检测BRAF基因突变的检测体系及其试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种检测BRAF基因突变的检测体系及其试剂盒，包括数字PCR预混液和引物探针混合液；引物探针混合液包括用于检测第600密码子V600E位点的上游引物、下游引物和肽核酸探针；上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，肽核酸探针的核苷酸序列与BRAF突变型基因第600密码子V600E位点完全互补且核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；所述肽核酸探针的5’端连接有由4个氨基酸构成的强螯合基团。本发明专利技术的检测BRAF基因突变的检测体系及其试剂盒灵敏度和特异性高，样品需求量少，可以快速便捷准确地进行PCR定量检测。

【技术实现步骤摘要】
检测BRAF基因突变的检测体系及其试剂盒
本专利技术涉及一种检测BRAF基因突变的检测产品，属于生物

技术介绍
BRAF基因位于染色体7q34，是人类最重要的原癌基因之一，编码一种丝/苏氨酸激酶，是EGFR通路RAS/RAF/MEK/MRK/MAPK中重要的转导因子，参与调控细胞生长、分化和凋亡等多种生理过程。研究表明，在恶性黑色肿瘤、肺癌、结直肠癌等多种恶性肿瘤中存在不同比率的BRAF基因突变，其中约82％突变位于外显子15第1799核苷酸上，T突变为A(T1799A)，导致其编码的谷氨酸由缬氨酸取代(V600E)，该突变使BRAF蛋白激活导致下游MEK-ERK信号通路持续激活，对肿瘤的生长增殖和侵袭转移至关重要。BRAF基因突变多见于黑素瘤患者，中国黑色素瘤患者BRAFV600E突变率约为26％，白种人约为50％，BRAFV600E突变患者对于激酶抑制剂类药物治疗有效，对该类药物使用具有重要的指导意义。有研究证明，野生型KRAS肿瘤当中，发生BRAFV600E突变的个体，对EGFR抑制剂类药物疗效减弱或无效，而没发生BRAF突变的野生型个体，32％有反应，68％没反应。这提示今后重点检测BRAF的突变可为今后结肠癌临床用药给予指导，BRAF基因突变的患者接受EGFR-TKI药物治疗的有效率低，BRAFV600E突变可导致部分KRAS基因野生型患者对EGFR-TKI及EGFR单抗药物治疗不敏感。因此检测肿瘤患者BRAF基因突变情况可用于指导EGFR-TKI的靶向用药。同时，BRAF基因也可作为患者预后评价的独立性指标，BRAFV600E突变患者呈现预后更差的趋势。外周血细胞游离DNA是来自正常细胞和肿瘤细胞死亡后释放的核酸片段总称。由于其再体内的半衰期较短且细胞释放的核酸会进入外周血，因此cfDNA较之于组织标本更能实时全面地反映患者体内的肿瘤情况。使用灵敏度较低的常规方法检测只能发现小部分患者在接受特定治疗前的肿瘤变异，采用高灵敏度法(如dPCR)检测则可以发现较高比例的携带突变型患者。数字PCR由于灵敏度等方面的优势，通过单分子扩增把低丰度的基因信号从复杂背景中分辨出来，可用于疾病或病毒的早期诊断或疗效监测。与常规的ARMs方法相比，数字PCR在检测血浆cfDNA时灵敏度明显优于ARMs法。PNA(peptidenucleicacid)中文名称肽核酸，是一种全新的人工合成DNA类似物，它与DNA分子的差异在于戊糖磷酸二酯键骨架被中性肽链酰胺2-氨基乙基甘氨酸键取代，其他结构与DNA一致。基于PNA的数字PCR技术主要依赖PNA探针的两个重要特性：第一，PNA只能与完全配对的互补DNA链杂交，只要有单一碱基发生错配，PNA就不能与互补的DNA链结合；第二，PNA寡聚体不能被DNA聚合酶识别，从而不会成为PCR扩增的引物。相反，它作为特定序列选择工具，可以阻止想应的PCR扩增。一旦模板中的目的基因发生突变并因此出现错配，DNA/PNA双链结合松动，DNA寡聚体模板链就可以正常延伸，作为PCR引物，使发生突变的样本在数字PCR中得到阳性扩增产物，而野生型基因则不会扩增。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种包含由强螯合基团修饰的肽核酸探针，灵敏度和特异性高模板DNA需求量少，可以快速便捷地进行精准定量PCR检测的BRAF基因突变检测检测体系及其试剂盒。本专利技术为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：一种检测BRAF基因突变的检测体系，包括数字PCR预混液和引物探针混合液；所述引物探针混合液包括用于检测第600密码子V600E位点的上游引物、下游引物肽核酸探针；所述上游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示，所述肽核酸探针的核苷酸序列与BRAF突变型基因第600密码子V600E位点完全互补且核苷酸序列如SEQIDNo.3所示；所述肽核酸探针核苷酸序列的5’端连接有由4个氨基酸构成的强螯合基团，4个氨基酸从5’至3’端依次为谷氨酸、丙氨酸、谷氨酸和谷氨酸，或者为天冬氨酸、丙氨酸、谷氨酸和谷氨酸。所述数字PCR预混液中包括DNA聚合酶、超纯水、dNTPs混合液、液滴稳定剂和缓冲液。所述肽核酸探针的5’端设有报告荧光基团FAM，所述肽核酸探针的3’端设有淬灭荧光基团BHQ。所述上游引物和下游引物在反应体系中的最终浓度均为0.1～0.3μM/L；所述肽核酸探针在反应体系中的最终浓度为0.18～0.25μM/L。本专利技术为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：一种采用上述检测体系的检测BRAF基因突变检测产品。本专利技术为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：一种检测BRAF基因突变的试剂盒，包括数字PCR预混液、引物探针混合液、阳性质控和阴性质控；所述引物探针混合液包括用于检测第600密码子V600E位点的上游引物、下游引物肽核酸探针；所述上游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示，所述肽核酸探针的核苷酸序列与BRAF突变型基因第600密码子V600E位点完全互补且核苷酸序列如SEQIDNo.3所示；所述肽核酸探针核苷酸序列的5’端连接有由4个氨基酸构成的强螯合基团，4个氨基酸从5’至3’端依次为谷氨酸、丙氨酸、谷氨酸和谷氨酸，或者为天冬氨酸、丙氨酸、谷氨酸和谷氨酸。所述数字PCR预混液包括DNA聚合酶、超纯水、dNTPs混合液、液滴稳定剂和缓冲液；所述阳性质控是含突变型BRAF基因标准质粒溶液；所述阴性质控是含野生型BRAF基因标准质粒溶液。所述上游引物和下游引物在反应体系中的最终浓度均为0.1～0.3μM/L；所述肽核酸探针B在反应体系中的最终浓度为0.18～0.25μM/L；所述肽核酸探针的5’端设有报告荧光基团FAM，所述肽核酸探针的3’端设有淬灭荧光基团BHQ。所述上游引物和下游引物在反应体系中的最终浓度为0.19μM/L；所述肽核酸探针在反应体系中的最终浓度分别为0.21μM/L。所述数字PCR预混液包括浓度为1U/μL的热启动Taq酶和UDG酶、浓度为4mM的MgCl2、浓度为50mM的pH值为8.3的Tris-HCl、浓度为300mM的dNTP、浓度为1.6μL/反应的液滴稳定剂。反应时，40体积的反应体系包括数字PCR预混液10体积，引物探针混合液10体积，模板1体积，灭菌超纯水19体积，所述模板的使用浓度为10ng/μL～100ng/μL。本专利技术为解决上述技术问题提出的一种技术方案是一种精准定量检测BRAF基因突变的检测方法，采用上述精准定量检测BRAF基因突变的试剂盒进行检测，具体检测方法包括如下步骤：(1)提取样本DNA：外周血全血1900×g离心后吸取血浆，16000×g再次离心，吸取上清液，使用QIAmpCirculatingNucleicAcidKid(德国Qiagen公司)抽提cfDNA。获得PCR扩增DNA模板；(2)配制数字PCR反应液：向步骤(1)处理后得到的DNA模板中分别加入灭菌水和所述试剂盒中的数字PCR预混液、引物探针混合液，配制得到样本的数字PCR反应液；(3)将步骤(2)制备的数字PCR反应液制作为油包水PCR微反应液滴，生成的微反应液滴数量本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测BRAF基因突变的检测体系，其特征在于：包括数字PCR预混液和引物探针混合液；所述引物探针混合液包括用于检测第600密码子V600E位点的上游引物、下游引物和肽核酸探针；所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述肽核酸探针的核苷酸序列与BRAF突变型基因第600密码子V600E位点完全互补且核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；所述肽核酸探针核苷酸序列的5’端连接有由4个氨基酸构成的强螯合基团，4个氨基酸从5’至3’端依次为谷氨酸、丙氨酸、谷氨酸和谷氨酸，或者为天冬氨酸、丙氨酸、谷氨酸和谷氨酸。

【技术特征摘要】
1.一种检测BRAF基因突变的检测体系，其特征在于：包括数字PCR预混液和引物探针混合液；所述引物探针混合液包括用于检测第600密码子V600E位点的上游引物、下游引物和肽核酸探针；所述上游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示，所述肽核酸探针的核苷酸序列与BRAF突变型基因第600密码子V600E位点完全互补且核苷酸序列如SEQIDNo.3所示；所述肽核酸探针核苷酸序列的5’端连接有由4个氨基酸构成的强螯合基团，4个氨基酸从5’至3’端依次为谷氨酸、丙氨酸、谷氨酸和谷氨酸，或者为天冬氨酸、丙氨酸、谷氨酸和谷氨酸。2.根据权利要求1所述的检测BRAF基因突变的检测体系，其特征在于：所述数字PCR预混液中包括DNA聚合酶、超纯水、dNTPs混合液、液滴稳定剂和缓冲液。3.根据权利要求1所述的检测BRAF基因突变的检测体系，其特征在于：所述肽核酸探针的5’端设有报告荧光基团FAM，所述肽核酸探针的3’端设有淬灭荧光基团BHQ。4.根据权利要求1至3中任一项所述的检测BRAF基因突变的检测体系，其特征在于：所述上游引物和下游引物在反应体系中的最终浓度均为0.1～0.3μM/L；所述肽核酸探针在反应体系中的最终浓度为0.18～0.25μM/L。5.一种采用如权利要求1所述的检测体系的检测BRAF基因突变检测产品。6.一种检测BRAF基因突变的试剂盒，其特征在于：包括数字PCR预混液、引物探针混合液、阳性质控和阴性质控；所述引物探针混合液包括用于检测第600密码子V600E位点的上游引物、下游引物和肽核酸探针；所述上游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.2所...

【专利技术属性】
技术研发人员：王明，赵国玲，洪专，
申请(专利权)人：上海赛安生物医药科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31