一种同步检测8种肿瘤相关长链非编码RNA的多重PCR方法技术

本发明专利技术应用GeXP多重分析技术成功建立了一种于单管中同时检测肝癌组织8种LncRNAs表达的检测方法，且不会产生假阳性及假阴性。多重RT‑PCR技术可扩增出各引物的特异性片段且无交叉反应，8种LncRNA引物扩增片段大小与设计相符，提示该方法引物特异性良好，可根据片段大小来区分各LncRNAs。且该方法灵敏度良好，可对最低0.25ng的总RNA进行检测。总之，本研究建立的GeXP多重检测体系可以作为一种有效、快捷且特异的检测与人肝癌有关的LncRNAs的新方法，为肝癌的诊断及预后奠定了一定的方法学基础。

【技术实现步骤摘要】
一种同步检测8种肿瘤相关长链非编码RNA的多重PCR方法
本专利技术属于肿瘤基因检测
，具体涉及一种可同步检测8种肿瘤相关长链非编码RNA的方法。
技术介绍
恶性肿瘤因高发病率及病死率严重危害人类健康与生存，早期诊断对改善患者预后至关重要，然而由于肿瘤早期症状的非特异性，多数患者发现时已属晚期；且由于肿瘤基因的不稳定性，有创的病理活检难以实行动态监测，往往导致治疗失败的发生，因此早期诊断、实时监测肿瘤进展且无创的检测方法亟待开发。虽然临床上诊断肿瘤的方法有细胞学、病理学检查及影像学诊断，但都有一定会的局限性和漏检率，此时肿瘤标志物检测在HCC的早期诊断中意义重大。甲胎蛋白作为传统的血清学诊断之一，广泛应用于临床，但存在一定的局限性：如一些肝炎、肝硬化、妊娠女性血清中甲胎蛋白也会升高出现假阳性。虽然有新的标志物，如高尔基体蛋白(Golgi-protein73，GP73)，热休克蛋白(heatshockprotein，HSP)等被陆续发现并应用于临床，联合检测可以提高检出率，但其大都属于蛋白水平的检测，影响因素较多。随着精准医疗的迅速发展，基因芯片、蛋白质芯片、微小RNA等技术手段也开始逐渐走进临床，但其操作繁琐，成本高，时间长。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种同步检测8种肿瘤相关长链非编码RNA(LncRNA)的多重PCR方法，从而弥补现有技术的不足。本专利技术经反复摸索，设计出一组LncRNA特异性的PCR引物和通用性的引物，实现了在一支反应管中对8种LncRNA基因的同步、高灵敏性、高特异扩增。本专利技术克服了多重PCR技术用于肿瘤LncRNA检测时存在的引物设计困难、反应相互干扰、扩增效率和准确度差等缺点，是现有肿瘤LncRNA同步检测技术的突破。本专利技术首先提供一种多重PCR的引物组，其中包含有：用于检测h-GAS5的引物对，其上游引物的序列为SEQIDNO:1，下游引物的序列为SEQIDNO:2；用于检测h-NEAT1的引物对，其上游引物的序列为SEQIDNO:3，下游引物的序列为SEQIDNO:4；用于检测h-H19的引物对，其上游引物的序列为SEQIDNO:5，下游引物的序列为SEQIDNO:6；用于检测h-MALAT1的引物对，其上游引物的序列为SEQIDNO:7，下游引物的序列为SEQIDNO:8；用于检测h-HOTAIR的引物对，其上游引物的序列为SEQIDNO:9，下游引物的序列为SEQIDNO:10；用于检测h-DANCR的引物对，其上游引物的序列为SEQIDNO:11，下游引物的序列为SEQIDNO:12；用于检测h-UCA1的引物对，其上游引物的序列为SEQIDNO:13，下游引物的序列为SEQIDNO:14；用于检测h-BCAR4的引物对，其上游引物的序列为SEQIDNO:15，下游引物的序列为SEQIDNO:16。所述的引物组用于制备检测GAS5、NEAT1、H19、MALAT1、HOTAIR、DANCR、UCA1和BCAR4的制品；所述的制品，优选为毛细管电泳制品；作为优选，上述的毛细管电泳制品上还设置有质控(QC-1)和空白对照质控(QC-2)；所述的质控(QC-1)为一段荧光素标记的优选的寡核苷酸序列，其序列为5′-ACAAGGGATATCGCTGGGT-3′(SEQIDNO:17)，该序列不产生稳定的二级结构，与上述肿瘤LncRNA的基因序列也没有同源性；空白对照质控(QC-2)为双蒸水。本专利技术所述的多重PCR和毛细管电泳制品用于非疾病诊断治疗目的基因检测，所述基因为长链非编码RNAGAS5、NEAT1、H19、MALAT1、HOTAIR、DANCR、UCA1和BCAR4。本专利技术还提供一种使用上述多重PCR和毛细管电泳制品检测长链非编码RNAGAS5、NEAT1、H19、MALAT1、HOTAIR、DANCR、UCA1和BCAR4是否存在的方法，检测不以疾病诊断治疗为目的；所述方法包括如下的步骤：1)提取待检测样品的RNA；采用Trizol试剂一步法冰上操作：(1)取组织块于无核酸酶的1.5mL离心管中，加入200μlTrizol试剂淹没组织标本，切割并研磨；(2)加入300μlTrizol，200μl三氯甲烷，剧烈震荡并涡旋15s；(3)13,000rpm/min离心15min；(4)轻轻吸取上清液加入至另一无核酸酶的1.5mL离心管中并加入等体积的异丙醇，稍混匀；(5)静置15min；(6)13,000rpm/min离心10min，弃上清，留沉淀；(7)加入浓度为75％的酒精(现配现用)125μl，吹打沉淀，制成垂悬液；(8)13,000rpm/min离心15min，弃上清，室温晾干8min；(9)加入50μl无核酸酶双蒸水，56℃温育10min至完全溶解；(10)用超微分光光度计测定总RNA浓度及纯度后置于-80℃保存备用。2)将提取的RNA反转录制备cDNA；以总RNA为模板，按照M-MLV第一链cDNA合成试剂盒配置，使各标本RNA量均为2500ng，建立20μl的反应体系，依次加入10种终浓度为200nmol/L的混合下游引物Mix2μl，10mMdNTP混合物1μl根据已测的RNA浓度使RNA总量达2500ng，最后以无核酸酶的双蒸水补足12μl，混合后，65℃加热5min，迅速置于冰上冷却。短暂离心后加入以下组分：5X第一链合成缓冲液4μl，0.1MDTT2μl，混匀后，在37℃孵育2min，加入M-MLV逆转录酶1μl，轻轻吹打混匀。然后37℃50min，70℃15min并终止反应，-20℃保存备用。单引物验证时，加入1μmol/L的单引物2ul其他反应步骤同上。同时，制备阳性质控、无模板质控和无反转录酶质控样品，其中阳性质控RNA用GenomeLabGeXPHumanReferencePlexkit试剂盒中的ControlRNATemplates。3)PCR反应：建立10μl反应体系，依次加入以下试剂，MgCl22μl，5XPCRBuffer2μl，10种终浓度为200nmol/L的混合上游引物Mix1μl，DNA聚合酶0.35μl，反转录产物cDNA4.65μl，混合均匀后，根据PCR结果对反应条件进行优化，最终确定反应条件为：95℃10min；94℃30s,58℃30s,70℃1min(35个循环)；4℃保存产物。做单引物验证时，PCR反应中加入1μmol/L的单引物1μl，其他反应步骤同上。4.GeXP上样：(1)置备DSS-400：SLS为1:80的混合液，混匀、震荡30s备用；(2)在GeXP样品板中加入40μl/孔的SLS/DSS混合液于，然后加入PCR产物1μl(无气泡)，震荡混匀10s，并加一滴石蜡油覆盖；(3)在与样品板对应的缓冲液板中加入3/4体积的分离缓冲液；(4)GeXP上机操作具体方法严格参照软件说明书并应用GeneExpress软件对基因表达进行相对定量结果分析。本专利技术应用GeXP多重分析技术成功建立了一种于单管中同时检测肝癌组织8种LncRNAs表达的检测方法，且不会产生假阳性及假阴性。多重RT-PCR技术可扩增出各引物的特异性片段且无交叉反应，8种LncRNA引物扩增片段大小与设计相符，提示该方法引物特异本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种多重PCR的引物组，其特征在于，所述的引物组中包含有：用于检测h‑GAS5的引物对，其上游引物的序列为SEQ ID NO:1，下游引物的序列为SEQ ID NO:2；用于检测h‑NEAT1的引物对，其上游引物的序列为SEQ ID NO:3，下游引物的序列为SEQ ID NO:4；用于检测h‑H19的引物对，其上游引物的序列为SEQ ID NO:5，下游引物的序列为SEQ ID NO:6；用于检测h‑MALAT1的引物对，其上游引物的序列为SEQ ID NO:7，下游引物的序列为SEQ ID NO:8；用于检测h‑HOTAIR的引物对，其上游引物的序列为SEQ ID NO:9，下游引物的序列为SEQ ID NO:10；用于检测h‑DANCR的引物对，其上游引物的序列为SEQ ID NO:11，下游引物的序列为SEQ ID NO:12；用于检测h‑UCA1的引物对，其上游引物的序列为SEQ ID NO:13，下游引物的序列为SEQ ID NO:14；用于检测h‑BCAR4的引物对，其上游引物的序列为SEQ ID NO:15，下游引物的序列为SEQ ID NO:16。

【技术特征摘要】
1.一种多重PCR的引物组，其特征在于，所述的引物组中包含有：用于检测h-GAS5的引物对，其上游引物的序列为SEQIDNO:1，下游引物的序列为SEQIDNO:2；用于检测h-NEAT1的引物对，其上游引物的序列为SEQIDNO:3，下游引物的序列为SEQIDNO:4；用于检测h-H19的引物对，其上游引物的序列为SEQIDNO:5，下游引物的序列为SEQIDNO:6；用于检测h-MALAT1的引物对，其上游引物的序列为SEQIDNO:7，下游引物的序列为SEQIDNO:8；用于检测h-HOTAIR的引物对，其上游引物的序列为SEQIDNO:9，下游引物的序列为SEQIDNO:10；用于检测h-DANCR的引物对，其上游引物的序列为SEQIDNO:11，下游引物的序列为SEQIDNO:12；用于检测h-UCA1的引物对，其上游引物的序列为SEQIDNO:13，下游引物的序列为SEQIDNO:14；用于检测h-BCAR4的引物对，其上游引物的序列为SEQIDNO:15，下游引物的序列为SEQIDNO:16。2.权利要求1所述的引物组在制备检测长链非编码RNA制品中的应用，所述的长链非编码RNA为GAS5、NEAT1、H19、MALAT1、HOTAIR、DANCR、UCA1或BCAR4。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的制品为毛细管电泳制品。4.一种用于检测长链非编码RNA的毛细管电泳制品，其特征在于，所述的毛细管电泳制品使用了权利要求1所述的引物组。5.如权利要求4所述的毛细管电泳制品，其特征在于，所述的毛细管电泳制品还包括有质控和空白对照质控。6.如权利要求5所述的毛细管电泳制品，其特征在于，所述的质控是荧光素标记的核苷酸序列为SEQIDNO:17的寡核苷酸片段。7.如权利要求5所述的毛细管电泳制品，其特征在于，所述的空白对照质控为双蒸水。8.权利要求1所述的引物组在非疾病诊断治疗目的基因检测中的应用，所述基因为长链非编码RNAGAS5、NEAT1、H19、MALAT1、HOTAIR、DANCR、UCA1或BCAR4。9.权利要求4所述的毛细管电泳制品在非疾病诊断治疗目的基因检测中的应用，所述基因为长链非编码RNAGAS5、NEAT1、H19、MALAT1、HOTAIR、DANCR、UCA1或BCAR4。10.一种使用权利要求1所述的引物组和权利要求4所述的毛细管电泳制品检测长链非编码RNAGAS5、NEAT1、H19、MALAT1、HOTAIR、DANCR、UCA1或BCAR4的方法，检测不以疾病诊断治疗为目的；所述方法包括如下的步骤步骤：1)提取待检测样品的RNA；采用Trizol试剂一步法冰上操作：(1)取组织块于无核酸酶的1.5mL离心管中，加入200μlTr...

【专利技术属性】
技术研发人员：王晔，张磊，牟晓峰，史俊英，
申请(专利权)人：青岛市中心医院，
类型：发明
国别省市：山东,37