一种快速检测ALK融合基因的方法及富集探针和探测引物，属于基因检测领域。该方法先设置SEQ ID：1‑28的富集探针捕获特异性匹配的DNA，再设置SEQ ID：29‑50中的任意一对探测引物通过PCR方法检测ALK融合基因是否存在。该方法是基于富集探针和探测引物检测ALK融合基因的方法，具有快速准确、对样品要求低、灵敏度与特异性高等的优点，能够大幅提高肺癌的精治疗水平。
【技术实现步骤摘要】
快速检测ALK融合基因的方法及富集探针和探测引物
本专利技术属于基因检测领域，具体涉及一种快速检测ALK融合基因的方法及富集探针和探测引物。
技术介绍
融合基因是指两个基因的全部或部分序列融合成一个新基因的过程，通常具有致癌性，对于肺癌ALK等融合基因尤为重要。传统的融合基因检测方法为荧光原位杂交方法，必须使用组织样品检测，且该方法存在检测通量低，人工判读对人员要求高，对样品质量要求高等缺点，限制了其应用。随着二代测序技术的发展，基于二代测序的方法衍生出了融合基因的检测新方法，具有灵敏度高，通量高，结果判断客观准确，可检测传统组织样品，同时可检测循环肿瘤DNA样品等优点，但是基于目前的测序仪器技术水平，存在检测周期长、成本高等缺点。肺癌已经成为我国发病率与死亡率最高的癌症，实现快速、准确检测ALK融合基因能够有效地提高肺癌的精准治疗水平，对社会具有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术解决的技术问题是提供一种快速检测ALK融合基因的方法及富集探针和探测引物，该方法是基于富集探针和探测引物检测ALK融合基因的方法，具有快速准确、对样品要求低、灵敏度与特异性高等的优点，能够大幅提高肺癌的精治疗水平。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案如下：本专利技术的一种快速检测ALK融合基因的富集探针，所述的富集探针序列选自SEQID：1-28所示的核苷酸序列中的两种以上。根据SEQID：1-28的富集探针进行捕获特异性匹配的DNA，在快速检测ALK融合基因中的应用。本专利技术的快速检测ALK融合基因的富集探针在制备诊断肿瘤产品中的用途。本专利技术的一种快速检测ALK融合基因的探测引物，所述的探测引物的序列为SEQID：29-50中的任意一对。本专利技术的快速检测ALK融合基因的探测引物在制备诊断肿瘤产品中的用途。一种用于诊断肿瘤的试剂盒，该试剂盒包括序列为SEQID：29-50的一对探针引物和PCR试剂。本专利技术的一种快速检测ALK融合基因的方法，包括以下步骤：步骤1：在ALK基因上的断点位置设置针对ALK基因的SEQID：1-28的富集探针，与富集探针特异性匹配的DNA被保留下来，从而捕获特异性匹配的DNA；步骤2：在捕获特异性匹配的DNA中，设置序列为SEQID：29-50的一对探测引物和Taqman探针，通过PCR方法扩增，检测ALK融合基因，用于探测最终富集的DNA中是否存在EML4的片段，根据结果进行分析，判定是否存在EML4-ALK融合基因。所述的根据结果进行分析，具体为根据ΔCT值进行分析；其中，ΔCT值＝目的基因CT值-内参基因CT值。本专利技术的快速检测ALK融合基因的方法中，正常人中不存在EML4融合基因，因此正常人只会保留ALK基因的DNA片段，而不会存在EML4基因的DNA片段；若测试样品中存在EML4-ALK融合基因，本来只能捕获ALK基因的探针，因ALK基因DNA片段是EML4的断点上游基因，最终富集的DNA中会同时存在EML4和ALK的DNA片段，通过对EML4片段进行扩增，即设置针对EML4的特异性探测引物和Taqman探针，用于探测最终富集的DNA中是否存在EML4的片段，就能反应是否存在EML4-ALK融合基因。本专利技术的一种快速检测ALK融合基因的方法及富集探针和探测引物，其先设置富集探针捕获特异性匹配的DNA，再设置探测引物通过PCR方法检测ALK融合基因是否存在。相比于现有技术，该方法具有检测速度快、对样品质量要求低、检测灵敏度与特异性高、检测成本相对较低等优点。附图说明图1为探测引物与富集探针的设置检测ALK融合基因的方法示意图。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。此外应理解，在阅读了本专利技术讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本专利技术作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。以下实施例中，探测引物与富集探针的设置检测ALK融合基因的方法示意图见图1。实施例一种快速检测ALK融合基因的方法，具体包括如下步骤：步骤1：提取血浆DNA或提取石蜡组织DNA；步骤2：富集DNA，具体包括以下子步骤：步骤2-1：对步骤1提取的DNA使用Qubit荧光定量仪器定量，取500ng步骤1提取的DNA，备用；步骤2-2：富集探针的准备，即Ph8.0IDTE溶解多种富集探针，使得终浓度为0.75pmol/ul；其中，富集探针序列如下表1所示：步骤2-3：将500ngDNA与5ugCot-1DNA混合，用真空浓缩仪干燥PCR管中成分，温度设置为60℃；步骤2-4：富集探针和DNA的杂交，即室温下解冻所有杂交试剂缓冲液，把表2中成分加入步骤2-3所述的PCR管中，室温孵育5-10min，用枪头上下吹打混匀，转移到200ul低吸附的PCR管中，热循环仪中95℃孵育10min，从热循环仪中取出样品，立即加入4ul的富集探针，震荡混匀，短暂离心，放入热循环仪中65℃孵育4h(仪器盖子温度设为75℃)，得到杂交序列；表2试剂体积(ul)2X杂交缓冲液8.5杂交缓冲液增强剂2.7无核酸纯水1.8步骤2-5：对于单个捕获反应，制备1X的工作液，准备链霉亲和素标记的磁珠；步骤2-6：杂交序列与磁珠结合，即将杂交好的样品转移到含有准备好的磁珠的PCR管中，用移液器上下吹打10次充分混匀，再将混匀的样本放入热循环仪中，65℃孵育45min，使DNA结合到磁珠上(盖子温度设为75℃)，在65℃孵育过程中，每隔12min涡旋震荡3秒确保磁珠仍处于悬浮状态；步骤2-7：清洗磁珠去除未结合的DNA，即取100ul预热好的1X洗液1进行65℃缓冲液清洗，再分别使用加200ul室温的1X洗液I、1X洗液II、1X洗液III进行清洗；步骤2-8：重悬磁珠，即从磁力架上取下离心管(含有已捕获DNA的磁珠)，离心管中加入20ul无核酸纯水，上下吹打10次，确保粘在离心管壁上的磁珠重悬。步骤3：杂交后的PCR扩增检测，具体包括以下子步骤：步骤3-1：按表3在PCR管中准备PCR混合物：表3试剂反应量(ul)2XHotStartReadyMix2510μM引物1(或内参引物1)2.510μM引物2(或内参引物2)2.5已捕获DNA的磁珠20总量50其中，引物或内参引物为探测引物，其序列如下表4所示：表4步骤3-2：短暂震荡混匀PCR混合物并离心，且确保磁珠悬浮在溶液中，PCR管放入实时荧光定量仪，保持仪器盖子温度为105℃，按以下表5的反应程序进行扩增：表5步骤4：结果判读，即ΔCT≥5，融合基因阳性；ΔCT≤3融合基因阳性；5＞ΔCT＞3，结果不确定，需加大模板量重新检测，所述的ΔCT按照以下公式进行计算：ΔCT值＝目的基因CT值-内参基因CT值。内参基因CT值为包含Primer-Forward11与Primer-Reverse11的反应管，在实时荧光定量仪上运行得到的CT值，目的基因CT值为包含Primer-Forward1-10与Primer-Reverse1-10每一反应管子在实时荧光定量仪上运行得到的CT值，只要任一管ΔCT值满足结果判读标准即可判读。序列表<110>苏州科诺医学检验所有限公司<120&本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种快速检测ALK融合基因的富集探针，所述的富集探针序列选自SEQ ID：1‑28所示的核苷酸序列中的两种以上。
【技术特征摘要】
1.一种快速检测ALK融合基因的富集探针，所述的富集探针序列选自SEQID：1-28所示的核苷酸序列中的两种以上。2.如权利要求1所述的快速检测ALK融合基因的富集探针，其特征在于，利用权利要求1所述的富集探针进行捕获特异性匹配的DNA，在快速检测ALK融合基因中的应用。3.如权利要求1所述的快速检测ALK融合基因的富集探针在制备诊断肿瘤产品中的用途。4.一种快速检测ALK融合基因的探测引物，所述的探测引物的序列为SEQID：29-50中的任意一对。5.如权利要求4所述的快速检测ALK融合基因的探测引物在制备诊断肿瘤产品中...
【专利技术属性】
技术研发人员：姬云，孙石磊，王晶晶，姬星河，舒畅，
申请(专利权)人：苏州科诺医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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