检测对虾虹彩病毒的RPA引物和探针、试剂盒及其方法技术

本发明专利技术公开了检测对虾虹彩病毒的RPA引物和探针、试剂盒及其方法；该RPA引物的核苷酸序列为：SHIV‑F：5’‑CAGATCAGAGCGCATTCGATCCCATAGGCACCGC‑3’；SHIV‑R：5’‑CGTAAGAGAACATGTGGTATCCGGTGAGTTCGGG‑3’；探针的核苷酸序列为：SHIV‑P：5’‑ATACGAATCTTCAGATCGTATTCCCGTGA‑FAM‑dT‑G‑THF‑C‑BHQ1‑dT‑GCCGATTACTTCTC‑P‑3’。本发明专利技术采用特定的RPA引物和探针组合，通过RPA技术检测对虾虹彩病毒，具有较高的灵敏度，最低检测极限可达到1fg/μL，以及较高的特异性，且出峰时间早，7min左右即可出峰，适用于对虾虹彩病毒隐性感染的早期监测。

RPA primers, probes, kits and methods for detection of Penaeus iridovirus

The present invention discloses RPA primers and probes, kits and methods for detection of Penaeus iridovirus; the nucleotide sequence of the RPA primer is SHIV F:5'CAGATCAGAGCGCATTCGATCCTAGCACCGC 3'; SHIV R: 5' CGTAGAACATGTGGTCAGGGTTCGGGGGGGGGGGGGGGGG 3'; and the nucleotide sequence of the probe is SHIV F:5'CAGATCAGCAGCATTCGCAGCATTCGGGGGGCACCGC 8209 TACGAATCTTCAGATCGTATTCCCGTGA FAM dT G THF C BHQ1 dT GCCGATTACTTC P 3'. The invention adopts a specific combination of RPA primers and probes to detect Penaeus iridovirus by RPA technology, which has high sensitivity, the minimum detection limit can reach 1 fg/muL, and high specificity. The peak time is early, and it can peak in about 7 minutes. It is suitable for early monitoring of latent infection of Penaeus iridovirus.

【技术实现步骤摘要】
检测对虾虹彩病毒的RPA引物和探针、试剂盒及其方法
本专利技术涉及分子生物学
，尤其涉及检测对虾虹彩病毒的RPA引物和探针、试剂盒及其方法。
技术介绍
虹彩病毒(iridescentvirus)属于虹彩病毒科，是一种二十面体对称的胞浆型、双链DNA病毒，该病毒的宿主很广，能够感染鱼类、两栖类和无脊椎动物。而感染该病毒会造成造血织组坏死，主要病征会出现体色变黑、鳃盖张开及鳃部出血的情况。对于该病的防治方法，国内外学者普遍认为，综合预防是相对有效的方法，即尽早发现疾病并采取诸多措施阻止病毒传播。对虾血细胞虹彩病毒(Shrimphemocyteiridescentvirus，SHIV)，最早由Lightner和Redman于1993年在靠近厄瓜多尔的对虾养殖场中的原糙对虾(ProtrachypeneprecipuaBurkenroad)中被发现，病虾症状为活力较差，肝胰腺明显萎缩，肌肉发白，肠道发红、断裂，空肠空胃，鳃、步足及游泳足发黑。建立灵敏、准确、快捷、方便的SHIV病原检测方法能更有效地预防对虾虹彩病毒病的发生，进一步降低养殖风险，是减少虹彩病发生和危害的重要途径。目前，对虾是否感染虹彩病毒的检验通常采用病理学显微镜观察、生化测定、免疫学试验、细胞培养和PCR等，这些方法耗时、耗力、操作复杂，很难适应当前快速、准确检测的需要。近年来，分子生物学出现了一种新型的等温扩增方法-重组酶聚合酶扩增(RecombinasePolymeraseAmplification，RPA)技术，该技术主要依赖于3种酶：能结合单链寡核苷酸引物的重组酶、单链DNA结合蛋白和DNA聚合酶，不需要模板的热循环，可以在恒定的低温条件下反应，反应的最佳温度为37～42℃，甚至可以在室温条件下(25℃)进行反应。在该方法中，重组酶在37～42℃恒温条件下可与引物DNA紧密结合，形成酶和引物的聚合体，当引物在模板DNA上搜索到与之完全互补的序列时，在单链DNA结合蛋白的帮助下，使模板DNA解链，并在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互补链，反应产物也是以指数级增长，其反应速度快，在少于30min内可以达到指数式的增长，可摆脱高端精密的温控循环系统，非常适用于现场快速检测(point-of-caretesting,POCT)。在RPA反应体系中加入含有荧光基团的探针，利用荧光信号的积累实时监控整个RPA扩增过程，可实现对起始模板的定性及定量分析。整个反应简单快速，因为不需要高温循环，所以特别适合在有大量样品的非实验室检测场所使用。目前，关于虾虹彩病毒的检测试剂盒的报道还较少，仅有采用RAA技术检测虾虹彩病毒的专利文献，即：申请公布号为CN107988428A专利技术专利申请公开了一种虾虹彩病毒(SIV)RAA恒温荧光检测方法和检测试剂盒，而采用RPA反应体系检测虾虹彩病毒的还未见报道。虽然，上述专利申请公开了与RPA技术较为接近的RAA恒温荧光检测方法，但是灵敏度还有待进一步提高，且出峰时间也较晚，有待改善。
技术实现思路
本专利技术的第一目的在于提供一种用于检测对虾虹彩病毒的RPA引物和探针，该引物的灵敏度高、特异性强且出峰时间早，适用于对虾虹彩病毒隐性感染的早期监测。本专利技术的第二目的在于提供用于检测对虾虹彩病毒的试剂盒，该试剂盒同样也具有高灵敏度、高特异性且出峰时间早的特点，适用于对虾虹彩病毒隐性感染的早期监测。本专利技术的第三目的在于提供一种用于检测对虾虹彩病毒的方法，该方法能够快速高效地进行扩增，不仅操作简便，而且鉴定也更为简便。具体技术方案如下：检测对虾虹彩病毒的RPA引物和探针组合，包括：一对引物和一个探针；其中，所述引物的核苷酸序列为：SHIV-F：5’-CAGATCAGAGCGCATTCGATCCCATAGGCACCGC-3’；SHIV-R：5’-CGTAAGAGAACATGTGGTATCCGGTGAGTTCGGG-3’；所述探针的核苷酸序列为：SHIV-P：5’-ATACGAATCTTCAGATCGTATTCCCGTGA-FAM-dT-G-THF-C-BHQ1-dT-GCCGATTACTTCTC-P-3’。RPA引物探针的设计是依据TwistDX提供的说明书进行操作。先设计探针，首先找到模板DNA中T*****T的区域，这对T碱基被1-5个碱基隔开，靠近5’端的T碱基被荧光基团(FAM)取代，3’端的T碱基被淬灭基团(BHQ1)取代，在隔开的中间碱基中挑一个用THF(tetrahydrofuran)取代；探针设计好后，可以在探针的前后寻找上下游引物，引物的长度一般在30-35bp左右，且上游引物需靠近探针，两者的距离不能相差太远，不能超过几十个碱基，扩增产物在200bp左右。本专利技术提供了所述的RPA引物和探针组合在用于制备检测对虾虹彩病毒的试剂盒和扩增反应试剂中的应用。本专利技术还提供了一种对虾虹彩病毒的检测试剂盒，该试剂盒中包含所述的RPA引物和探针组合。进一步地，所述检测试剂盒还包括RPA扩增试剂；所述RPA扩增试剂包括RPA缓冲液、链置换DNA聚合酶、单链DNA结合蛋白、UvsX重组酶、UvsY重组酶和280mM醋酸镁溶液。进一步地，所述检测试剂盒还包括阳性对照和阴性对照；所述阳性对照为含有对虾虹彩病毒majorcapsidprotein(MCP)基因片段的T载体；所述阴性对照为超纯水。本专利技术还提供了一种基于RPA技术检测对虾虹彩病毒的方法，包括：(1)提取待检样品的DNA；(2)利用权利要求1所述检测对虾虹彩病毒的RPA引物和探针组合对所述DNA进行恒温基因扩增反应，并根据扩增产物的荧光变化判断扩增结果。进一步地，所述恒温基因扩增反应的体系包括：总体积为50μL；其中，RPABuffer29.5μL，10μMSHIV-F2.1μL，10μMSHIV-R2.1μL，10μMSHIV-P0.6μL，280mMMgOAC2.5μL，待检DNA1～100ng，余量为ddH2O。上述体系中还设置有阳性对照和阴性对照；所述阳性对照为含有对虾虹彩病毒MCP基因片段的T载体；所述阴性对照为超纯水。上述体系中还添加有RPA冻干粉。将配制好的反应管混匀后离心，并于等温扩增仪上；所述等温扩增的反应条件为：39℃反应20～40min。进一步地，所述判断扩增结果的方法为：收集荧光信号，如果出现“S”型扩增曲线则判定为阳性；如果无“S”型扩增曲线，则判定为阴性。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：(1)本专利技术采用特定的RPA引物和探针组合，通过RPA技术检测对虾虹彩病毒，具有较高的灵敏度，最低检测极限可达到1fg/μL，以及较高的特异性，且出峰时间早，7min即可左右出峰，适用于对虾虹彩病毒隐性感染的早期监测。(2)快速高效：整个扩增只用20～40min即可完成，扩增产量可达109～1010个拷贝。(3)操作简便：不需要复杂的仪器，不需要特殊试剂，不需要预先进行双链DNA的变性等繁琐步骤，只需要控制反应温度为37℃～42℃就能反应和检测，条件比较温和。(4)高特异性：本专利技术设计的引物和探针具有极高的特异性，且非常稳定，能有效的避免非特异性扩增而产生的假阳性。(5)高灵敏度：本专利技术的最低检测极限可达到1fg/μL。(6)鉴定简便：本专利技术可根本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.检测对虾虹彩病毒的RPA引物和探针组合，其特征在于，包括：一对引物和一个探针；其中，所述引物的核苷酸序列为：SHIV‑F：5’‑CAGATCAGAGCGCATTCGATCCCATAGGCACCGC‑3’；SHIV‑R：5’‑CGTAAGAGAACATGTGGTATCCGGTGAGTTCGGG‑3’；所述探针的核苷酸序列为：SHIV‑P：5’‑ATACGAATCTTCAGATCGTATTCCCGTGA‑FAM‑dT‑G‑THF‑C‑BHQ1‑dT‑GCCGATTACTTCTC‑P‑3’。

【技术特征摘要】
1.检测对虾虹彩病毒的RPA引物和探针组合，其特征在于，包括：一对引物和一个探针；其中，所述引物的核苷酸序列为：SHIV-F：5’-CAGATCAGAGCGCATTCGATCCCATAGGCACCGC-3’；SHIV-R：5’-CGTAAGAGAACATGTGGTATCCGGTGAGTTCGGG-3’；所述探针的核苷酸序列为：SHIV-P：5’-ATACGAATCTTCAGATCGTATTCCCGTGA-FAM-dT-G-THF-C-BHQ1-dT-GCCGATTACTTCTC-P-3’。2.如权利要求1所述的RPA引物和探针组合在用于制备检测对虾虹彩病毒的试剂盒和扩增反应试剂中的应用。3.一种包含权利要求1所述的RPA引物和探针组合的检测试剂盒。4.如权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，检测试剂盒还包括RPA扩增试剂；所述RPA扩增试剂包括RPA缓冲液、链置换DNA聚合酶、单链DNA结合蛋白、UvsX重组酶、UvsY重组酶和280mM醋酸镁溶液。5.如权利要求3所述的检测试剂盒，...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄俊，张徐俞，陈刚，薛辉利，郑晓叶，付嫒媛，杨稳，骆志成，樊伟东，
申请(专利权)人：杭州奥盛仪器有限公司，浙江科技学院，浙江省水产技术推广总站，
类型：发明
国别省市：浙江,33