一种猪肠道冠状病毒4重荧光定量PCR检测试剂盒制造技术

发明专利技术公开一种猪肠道冠状病毒4重荧光定量PCR检测试剂盒，其内包括有序列为SEQ ID No.1～SEQ ID No.8的八条六碱基随机反转录引物，及序列为SEQ ID No.9～SEQ ID No.12的四条探针引物。本发明专利技术试剂盒中的引物是根据引起猪消化道病毒病主要病原的保守基因的高度保守区设计特异性引物，所建立的检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪δ冠状病毒和猪肠道α冠状病毒的4重荧光定量PCR检测方法，为及时治疗和防控疫情提供最直接的依据，为养猪业的健康发展保驾护航。

A Quantitative Reagent Kit for Detection of Porcine Intestinal Coronavirus by Quantitative Quantitative Four-fold Fluorescence Polymerase Chain Reaction

A four-fold fluorescence quantitative PCR kit for detection of porcine enteric coronavirus was invented and disclosed. The kit includes eight six-base random reverse transcription primers orderly listed as SEQ ID No.1-SEQ ID No.8 and four probe primers sequenced as SEQ ID No.9-SEQ ID No.12. The primers in the kit are designed according to the highly conservative regions of the conservative genes causing the main pathogens of porcine digestive tract virus diseases, and the 4 fluorescent quantitative PCR detection methods for detecting porcine epidemic diarrhea virus, swine transmissible gastroenteritis virus, swine delta coronavirus and pig intestinal alpha coronavirus are timely. Treatment and prevention of epidemic situation provide the most direct basis for the healthy development of pig industry escort.

【技术实现步骤摘要】
一种猪肠道冠状病毒4重荧光定量PCR检测试剂盒
本专利技术涉及一种兽医用检测试剂盒及这种检测试剂盒在非疾病检测的使用方法，确切讲本专利技术是一种用于猪肠道冠状病毒4重荧光定量PCR及相应的使用方法，所述的4重猪病毒性腹泻病毒是指：猪流行性腹泻病毒，猪传染性胃肠炎病毒，猪δ冠状病毒和猪肠道α冠状病毒。
技术介绍
猪病毒性腹泻是严重危害养猪业的重要传染病之一，造成猪病毒性腹泻的最主要传统病原有猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)。近年来，新发现了猪δ冠状病毒(PDCoV)和猪肠道α冠状病毒(PEAV)，这两种冠状病毒同样对仔猪危害严重。这些病毒是当前引起猪群或猪场发生病毒性腹泻主要病原，危害重大，且存在混合感染，对仔猪致死率为50％-100％不等，对养猪业造成极大的经济损失。除此之外，上述几种病毒引起的病毒性腹泻的临床症状、病理变化、流行特点极其相似，仅凭临床诊断很难进行鉴别诊断，常导致误诊，因此该病的防控及其早期诊断及鉴别诊断显得尤为重要。然而，腹泻病的病因复杂以及现有诊断方法的局限性，导致基层兽医和养殖场对腹泻病的确诊很困难，使腹泻病的防控不能做到有的放矢、对症下药。导致该现象发生的最根本原因是现地缺少可应用的快速、准确、方便的商品化检测方法。长期以来针对猪病毒性腹泻的检测试剂盒主要是以传统的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)的血清学检测方法为主，然而，近年来猪病毒性腹泻疫情发生了两个重大变化：第一，主要引起哺乳仔猪发病、死亡，而哺乳仔猪免疫系统尚未发育健全，未能有效产生血清抗体；第二，在患猪肠道中新发现了具有高度致病力的猪δ冠状病毒和猪肠道α冠状病毒，针对于此两种病毒目前尚未有成熟的检测方法。由此可见，现有的检测猪病毒性腹泻的检测试剂盒并不能满足目前疫病诊断的需求，因此急需研制符合当前疫情流行趋势的商品化检测试剂盒，且目前没有可以一次性检测、诊断、鉴别和定量检测上述4种病原的商品化试剂盒。
技术实现思路
本专利技术提供一种可克服现有不足的，具有特异、敏感、快速、使用方便、廉价的、可用于检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪δ冠状病毒和猪肠道α冠状病毒的检测试剂盒，同时提供这一试剂盒在非疾病诊断检测中的使用方法。本专利技术的一种猪肠道冠状病毒4重荧光定量PCR检测试剂盒内包括有序列为SEQIDNo.1、SEQIDNo.2、SEQIDNo.3、SEQIDNo.4、SEQIDNo.5、SEQIDNo.6、SEQIDNo.7、SEQIDNo.8的八条引物，及序列为SEQIDNo.9、SEQIDNo.10、SEQIDNo.11、SEQIDNo.12的四条探针。优选地，本专利技术的一种猪肠道冠状病毒4重荧光定量PCR检测试剂盒内还有：B.由预混的反转录缓冲液、六碱基随机引物、dNTP、RNA酶抑制剂、反转录酶和DEPC水组成的反转录预混体系；C.由PCR缓冲液、dNTP、Taq酶、双蒸水组成的PCR扩增预混体系；D.不同浓度阳性cDNA对照；E.阴性cDNA对照。本专利技术的一种猪肠道冠状病毒4重荧光定量PCR检测试剂盒，在非疾病诊断的使用方法是：先从待检猪的待检样品中提取RNA，利用试剂盒内的六碱基随机反转录引物和探针引物反转录为cDNA，得到的待检cDNA为模板，用试剂盒内的荧光定量PCR扩增预混体系(C)进行扩增，根据扩增产物的标准曲线及Ct值，参照阳性(D)和阴性(E)对照确定待检猪样品是否感染猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪δ冠状病毒和猪肠道α冠状病毒。本试剂盒仅对待检测样品中特定病毒的存在情况进行检测，不作为疾病诊断的直接依据。由前述内容可知，本专利技术是一种猪肠道冠状病毒4重荧光定量PCR检测试剂盒，以及这种检测试剂盒的非疾病诊断使用方法。本专利技术根据病原的保守基因的高度保守区设计特异性引物，利用不同标记的针对不同病原的特异性探针，实现了对猪肠道冠状病毒的检测。根据不同标记的探针、标准曲线及Ct值可以准确的判定猪病毒性腹泻病料中的病原，快速确定是单一病原感染引起还是混合感染造成。该方法方便快捷，不仅能为对症治疗提供依据，还可为猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪δ冠状病毒和猪肠道α冠状病毒的流行病学调查提供可靠的信息。本专利技术试剂盒中的引物是根据引起猪消化道病毒病主要病原的保守基因的高度保守区设计特异性引物，根据不同标记的探针、标准曲线及Ct值，建立了检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪δ冠状病毒和猪肠道α冠状病毒的4重荧光定量PCR检测方法，为及时治疗和防控疫情提供最直接的依据，为养猪业的健康发展保驾护航。本专利技术在单一PCR反应中对四种不同的猪肠道冠状病毒进行定量检测，操作简单、快速，反应高效、特异，与其他常见的猪病毒基因组无交叉反应；待检测样品包括肠道组织、肠内容物和粪便等多种样品，该类样品便于采集和保存。因此，本专利技术实用性强，受众广泛，便于推广。附图说明图1：猪流行性腹泻病毒单一荧光定量PCR扩增Ct值；图2：猪流行性腹泻病毒单一荧光定量PCR扩增曲线；图3：猪流行性腹泻病毒单一荧光定量PCR扩增的标准曲线；图4：猪传染性胃肠炎病毒单一荧光定量PCR扩增Ct值；图5：猪传染性胃肠炎病毒单一荧光定量PCR扩增曲线；图6：猪传染性胃肠炎病毒单一荧光定量PCR扩增的标准曲线；图7：猪δ冠状病毒单一荧光定量PCR扩增Ct值；图8：猪δ冠状病毒单一荧光定量PCR扩增曲线；图9：猪δ冠状病毒单一荧光定量PCR扩增的标准曲线；图10：猪肠道α冠状病毒单一荧光定量PCR扩增Ct值；图11：猪肠道α冠状病毒单一荧光定量PCR扩增曲线；图12：猪肠道α冠状病毒单一荧光定量PCR扩增的标准曲线；图13：不同病毒单一引物分别对猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪δ冠状病毒和猪肠道α冠状病毒标准品的扩增Ct值；图14：猪流行性腹泻病毒单一引物在猪肠道冠状病毒4重荧光定量PCR检测试剂盒中的敏感性扩增曲线；图15：猪传染性胃肠炎病毒单一引物在猪肠道冠状病毒4重荧光定量PCR检测试剂盒中的敏感性扩增曲线；图16：猪δ冠状病毒单一引物在猪肠道冠状病毒4重荧光定量PCR检测试剂盒中的敏感性扩增曲线；图17：猪肠道α冠状病毒单一引物在猪肠道冠状病毒4重荧光定量PCR检测试剂盒中的敏感性扩增曲线；图18：不同病毒单一引物分别对猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪δ冠状病毒和猪肠道α冠状病毒标准品检测的标准曲线；图19：猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪δ冠状病毒和猪肠道α冠状病毒4重荧光定量PCR检测试剂盒最佳反应条件扩增Ct值；图20：猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪δ冠状病毒和猪肠道α冠状病毒4重荧光定量PCR检测试剂盒最佳反应条件扩增曲线及标准曲线；图21：猪肠道冠状病毒4重荧光定量PCR检测试剂盒检测方法特异性检测结果；图22：猪肠道冠状病毒4重荧光定量PCR检测试剂盒方法特异性检测的扩增曲线及标准曲线；图23：单一肠道冠状病毒在4重荧光定量PCR检测试剂盒三次批间重复检测结果；图24：猪肠道冠状病毒4重荧光定量PCR检测试剂盒第一次批间重复检测结果；图25：猪肠道冠状病毒4重荧光定量PCR检测试剂盒第一次批间重复检测的扩增曲线；图26：猪肠道冠本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种猪肠道冠状病毒4重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于试剂盒内包括有序列为SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8的八条引物，及序列为SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12的四条探针。

【技术特征摘要】
1.一种猪肠道冠状病毒4重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于试剂盒内包括有序列为SEQIDNo.1、SEQIDNo.2、SEQIDNo.3、SEQIDNo.4、SEQIDNo.5、SEQIDNo.6、SEQIDNo.7、SEQIDNo.8的八条引物，及序列为SEQIDNo.9、SEQIDNo.10、SEQIDNo.11、SEQIDNo.12的四条探针。2.根据权利要求1所述的一种猪肠道冠状病毒4重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于试剂盒内还有：A.六碱基随机引物；B.由预混的反转录缓冲液、dNTP、RNA酶抑制剂、反转录酶和DEPC水组成的反转录预混体系；C.由PCR缓...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘光亮，陈佳宁，黄鑫，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃,62