一种用于检测绵羊边界病的试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种用于检测绵羊边界病的试剂盒，其包含特异性检测绵羊边界病病毒BDV的试剂。本发明专利技术的试剂盒可以有效的检测绵羊边界病病毒，所述试剂盒可快速实现BDV的定量检测，从而达到快速有效的检测绵羊边界病病毒的目的。

A Kit for Detecting Sheep Border Disease

The invention relates to a kit for detecting sheep borderline disease, which comprises a specific reagent for detecting sheep borderline disease virus BDV. The kit of the invention can effectively detect sheep borderline disease virus, and the kit can quickly realize quantitative detection of BDV, thereby achieving the purpose of rapid and effective detection of sheep borderline disease virus.

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测绵羊边界病的试剂盒
本专利技术涉及兽医医学检测领域，具体的说，是涉及一种用于检测绵羊边界病的试剂盒。
技术介绍
边界病(borderdisease，BD)，因首先发现于英格兰和威尔士的边界地区而得此名，又称羔羊被毛颤抖病(Hairyshakerdiseaseoflambs)，是由边界病病毒(borderdiseasevirus，BDV)引起新生羔羊以身体多毛，生长不良和神经异常为主要特征的一种先天性传染病。绵羊边界病病毒有免疫抑制作用，怀孕期感染边界病病毒后，无论胎儿是否具有免疫应答能力，病毒均可在体内的各种组织中持续存在而成为病毒的携带者和疾病的传染源。被感染的羔羊在生长成熟后的几年内，仍具有对其后代的感染性，子宫和卵巢或睾丸生殖细胞中存在的病毒，可经胎盘和精液发生垂直传播。感染了绵羊边界病病毒的成年羊主要表现为繁殖力下降和流产。羔羊表现为发育不良和畸形，多见断奶羊死亡。边界病病毒可以在胎羊肾细胞、绵羊脉络丛细胞，PK15细胞系和牛睾丸等细胞上生长，病毒的复制是在胞浆内进行的。根据是否能在细胞培养中出现病变作用，区别为致细胞病变毒株和非致细胞病变毒株，分离到的大多数边界病病毒是非致细胞病变的。边界病病毒可能存在不同的抗原型。该病最典型症状是感染的母羊生出小而弱的羔羊，有不同程度的振颤，细毛绵羊可能表现为被毛粗乱，羔羊叫声低沉、颤抖，有的站立困难，由于颤抖无法自己吸乳，有的羔羊表现为长趾，俗称“骆驼腿”，有的表现为骨骼畸型、小脑袋、骨骼细长。自然条件下，许多病羔羊在出生后头几周内死亡，未死亡的羔羊表现为振颤或可逐渐好转，并可在大约20周龄左右消失，死亡可一直延续到整个哺乳期及断奶以后。后期的死亡是由于重度腹泻或呼吸系统疾病所致，很可能是继发感染的结果。因此如果能够在发病早期及时的诊断出绵羊边界病，将大大提高治疗效果，而现有的常规检测方法均无法有效的在早期检测出绵羊边界病，因此，迫切的需要提供一种早期诊断绵羊边界病的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用于检测绵羊边界病的试剂盒，具体来说是一种检测绵羊边界病的试剂盒。本专利技术的一个技术方案是提供一种检测绵羊边界病的试剂盒，其包含特异性检测绵羊边界病病毒BDV的试剂。优选地，所述试剂包括反转录引物、正向引物、反向引物，所述反转录引物序列如SEQIDNO：1所示，所述正向引物的序列如SEQIDNO：2所示，所述反向引物的序列如SEQIDNO：3所示。本专利技术的另一个技术方案是提供SEQIDNO：1-3在用于制备检测绵羊边界病病毒的试剂盒中的用途。专利技术人在前期的细胞学试验中，通过差显表达的方法发现绵羊边界病病毒BDV的表达量与绵羊边界病密切相关，绵羊边界病病毒BDV的高表达预示着绵羊边界病的发生，为了进一步证实该结论，专利技术人又通过临床样本统计学实验进一步证实了该相关性。本专利技术的试剂盒可以有效地检测绵羊边界病，所述试剂盒可快速实现BDV的定量检测，从而达到快速有效的检测绵羊边界病的目的。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术的技术方案做进一步的详述，但本专利技术不限于以下实施例。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。实施例1样本收集收集50例绵羊边界病和25例正常绵羊血液。实施例2样品总RNA的提取1.血清总RNA的提取1)将收集的血液标本0.25ml，加入3倍体积TRIzol(0.75ml)，充分振荡混匀。2)将匀浆样品在15-30℃放置5min。3)离心10min(12000rpm，4℃)，取上清。4)加0.2ml氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。5)离心15min(12000rpm，4℃)。把上层水相(约500μl)转移到新管中。6)在得到的水相溶液中加入等体积异丙醇，混匀，室温放置30min。7)离心10min(12000rpm，4℃)，去上清。离心后RNA在管侧和管底形成胶状沉淀。8)加入1ml75％乙醇洗涤沉淀。9)离心3min(5000rpm，4℃)。倒出液体，剩余的少量液体短暂离心，然后用枪头吸出。10)室温放置晾干，加入30μl无RNA酶的水，充分溶解。11)紫外分光光度计检测测量所提取RNA的浓度和纯度。12)电泳检测：琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，电泳结果显示总RNA均有清晰的28s和18s条带，RNA完好无降解，质量符合进一步反转录实验要求。2.BDV逆转录使用天根公司FastQuantRTKit快速反转录试剂盒合成第一链cDNA1)将模板RNA在冰上解冻；解冻后迅速置于冰上。2)按下表基因组DNA的去除体系配制混合液，彻底混匀。简短离心，并置于42℃，孵育3min。然后置于冰上放置。基因组DNA的去除体系组成成分使用量5*gDNABuffer2μlTotalRNA1μl无RNA酶水7μl3)按下表反转录反应体系配制混合液。反转录反应体系：组成成分使用量10*FastRTBuffer2μlRTEnzymeMix1μl反转录引物2μl无RNA酶水10μl上表中反转录引物序列为：CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCCTGTG(SEQIDNO:1)。同时反转录U6,其反转录引物RT-U6序列为：CGCTTCACGAATGCGTGTCAT(SEQIDNO:4)。4)将反转录反应中的混合液，加到基因组去除步骤的反应液中，充分混匀。5)42℃，孵育15min。6)95℃，孵育3min之后放于冰上，得到cDNA。实施例3荧光定量PCR检测绵羊边界病和对照组BDV的表达1)荧光定量PCR试剂盒采用天根公司的FastFireqPCRPreMix(SYBRGreen)。首先，融解FastFireqPCRPreMix，模板，引物和无RNA酶水，并将所有试剂在室温下溶解并彻底混匀。接下来配制荧光定量PCR体系。荧光定量PCR体系组成成分浓度体积(μl)2*FastFireqPCRPreMix1*10正向引物(10μM)300nM0.6反向引物(10μM)300nM0.6cDNA模板-1无RNA酶水-7.8总体积-20BDV表达检测每个样品设置3个平行反应，以snRNAU6作为内参。上表中正向引物序列为：ACACTCCAGCTGGGCGAGGGGTAGAGAGCA(SEQIDNO:2)。上表中反向引物序列为：TGGTGTCGTGGATCG(SEQIDNO:3)。同时以U6作为内参，正向引物：GCTTCGGCAGCACATATACTAAAT(SEQIDNO:5)；反向引物：CGCTCACGAATTTGCGTGTCAT(SEQIDNO:6)。荧光定量PCR程序：2)统计学分析统计学分析方法组间采用t检验，p＜0.05定为有统计学意义。分析绵羊边界病与正常对照组之间外周血绵羊边界病病毒BDV的表达水平，结果显示绵羊边界病中绵羊边界病病毒BDV的表达明显高于正常组织。上述临床实验表明，通过检测绵羊边界病病毒BDV的表达水平可以有效的检测绵羊边界病。以上实施例仅仅是本专利技术的几个实施例，但本专利技术并非局限于此。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出任何创造性劳动的前提下所得到的所有其他实施方式，都属于本专利技术所保护的范围。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测绵羊边界病的试剂盒，其特征在于：包含特异性检测绵羊边界病病毒BDV的试剂。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测绵羊边界病的试剂盒，其特征在于：包含特异性检测绵羊边界病病毒BDV的试剂。2.根据权利要求1所述的用于检测绵羊边界病的试剂盒，其特征在于：所述试剂包括反转录引物、正向引物、反向引物，所述反转录引物序列如SEQIDNO：1所示，所述正向引物的序列如SEQIDNO：2所示，所述反向引物的序列如SEQIDNO：3所示。...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘欢，
申请(专利权)人：刘欢，
类型：发明
国别省市：江西,36