用于鉴别DAdV-3和DAdV-A的引物和酶及其应用制造技术

本发明专利技术提供用于鉴别DAdV‑3和DAdV‑A的引物和酶及其应用，属于鸭病学研究领域，采用了如SEQ ID NO.1‑2所示的引物和SalⅠ酶，建立能够对我国鸭群中出现的两种鸭腺病毒（DAdV‑3和DAdV‑A）的鉴别诊断方法，该方法的敏感性和PCR相当，仅仅只需对PCR产物进行额外10min酶切后再进行常规琼脂糖凝胶电泳，简单实用、方便快捷，为在鸭群中开展腺病毒分子流行病毒学调查和科学防控相关疫病提供支撑，具有十分重要的研究意义。

Primers and Enzymes Used to Identify DAdV-3 and DAdV-A and Their Applications

The present invention provides primers and enzymes for identifying DAdV_3 and DAdV_A and their applications. It belongs to the field of duck disease research. Using primers and Sal I enzymes as shown in SEQ ID NO.1_2, it establishes a differential diagnosis method for two duck adenoviruses (DAdV_3 and DAdV_A) that can occur in duck flocks in China, the sensitivity of the method and the PCR of the method. Quite simply, only 10min enzyme digestion of PCR products and routine agarose gel electrophoresis are simple, practical, convenient and quick. It is of great significance to support adenovirus molecular epidemiology, virology investigation and scientific prevention and control of infectious diseases in ducks.

【技术实现步骤摘要】
用于鉴别DAdV-3和DAdV-A的引物和酶及其应用
本专利技术属于鸭病学研究领域，具体涉及用于鉴别DAdV-3和DAdV-A的引物和酶及其应用。
技术介绍
腺病毒颗粒为无囊膜、核衣壳呈二十面体对称、线性、双链DNA病毒，其基因组全长约为33kd左右。其中，六邻体蛋白（Hexon）是腺病毒科各属病毒最主要的结构蛋白，每个Hexon蛋白表面携带有病毒主要的属的种特异性抗原决定簇，是病毒中和抗体的靶目标，含有病毒主要的保护性抗原基因簇，与病毒的致病性密切相关。根据国际病毒分类委员会（InternationalCommitteeonTaxonomyofViruses，ICTV）的最新分类（https://talk.ictvonline.org/），腺病毒科（Family:Adenoviridae）下设5个属（Genera），分别为富AT腺病毒属(Genus:Atadenovirus)、禽腺病毒属(Genus:Aviadenovirus)、鱼腺病毒属(Genus:Ichtadenovirus)、哺乳动物腺病毒属(Genus:Mastadenovirus)和唾液酸酶病毒属(Genus:Siadenovirus)。研究发现，禽类中存在多种腺病毒感染，其中感染鸡的腺病毒有5种：禽腺病毒A型（FowlaviadenovirusA，FAdV-A）、禽腺病毒B型（FowlaviadenovirusB，FAdV-B）、禽腺病毒C型（FowlaviadenovirusC，FAdV-C）、禽腺病毒D型（FowlaviadenovirusD，FAdV-D）、禽腺病毒E型（FowlaviadenovirusE，FAdV-E），均属于禽腺病毒属。感染火鸡（Turkey）的腺病毒有4种，分别属于腺病毒科的两个属，其中火鸡腺病毒B型（TurkeyaviadenovirusB）、火鸡腺病毒C型（TurkeyaviadenovirusC）和火鸡腺病毒D型（TurkeyaviadenovirusD）属于禽腺病毒属；而火鸡唾液酸酶病毒A型（TurkeysiadenovirusA）属于唾液酸酶病毒属。感染鹦鹉(Psittacine)的的腺病毒有2种，分别属于腺病毒科的两个属，其中鹦鹉富AT腺病毒属A型（PsittacineatadenovirusA）属于富AT腺病毒属；而鹦鹉腺病毒B型（PsittacineaviadenovirusB）属于禽腺病毒属。近年来，随着我国水禽（尤其是鸭）饲养规模的不断扩大，养殖模式的发展，水禽中新发疫病也越来越多、越来越复杂。鸭群中腺病毒感染也存在分属腺病毒科不同腺病毒属的相关报道，有属于富AT腺病毒属的鸭腺病毒A型（duckadenovirusA，缩写为DAdV-A）。2014年，随着高通量技术的发展，MarekA等测定了1株鸭源腺病毒（GR株，GenBank登录号NC024486）全基因组序列，并将其命名为鸭腺病毒2型（duckadenovirus2，DAdV-2），并基于基因组特点和遗传进化特征将其归为禽腺病毒属成员（MarekA,KajánGL,KosiolC,etal.Completegenomesequencesofpigeonadenovirus1andduckadenovirus2extendthenumberofspecieswithinthegenusAviadenovirus[J].Virology,2014,462-463:107-114.），随后ICTV将其科学命名为鸭腺病毒B型（duckaviadenovirusB，以区别属于富AT腺病毒属的DAdV-A）。随后，2014年以来，在我国番鸭中出现一种新的鸭腺病毒（CH-GD-2014株，GenBank登录号KR135164），该病毒和DAdV-2分离株GR株存在以下明显区别：①其全基因组序列和GR株的核苷酸同源性仅为92.3%；②CH-GD-2014株和GR株的Hexon基因的核苷酸同源性仅为76.6%，低于80.0%；③CH-GD-2014株有2个纤突蛋白（Fiber1、Fiber2），而GR株只有1个纤突蛋白（Fiber）。基于上述特征表明，我国鸭群中流行一种新的鸭腺病毒，并将其命名为鸭腺病毒3型（duckadenovirus3，DAdV-3）（周镇海．鸭腺病毒3型基因组序列分析及致病性研究[D]．华南农业大学硕士论文，2016．）。这就给DAdV-3和DAdV-A带来现实需求，一般而言，对两个病原进行鉴别诊断，需要针对2个病原的分别设计引物（即共需要4条引物），来建立鉴别诊断方法。本研究基于DAdV-3和DAdV-A的Hexon基因保守区核苷酸序列特征，建立一种仅需2条引物即可DAdV-3和DAdV-A进行同时扩增，但在扩增区域存在SalⅠ酶多态性差异（即PCR扩增区域存在SalⅠ酶酶切位点差异），对酶切产物进行常规琼脂糖凝胶电泳即可有效区分。该方法的敏感性和PCR相当，仅仅只需对PCR产物进行额外10min酶切（无需对产物进行胶回收）后再进行电泳，简单实用、方便快捷，尤其可对DAdV-3和DAdV-A混合感染进行精准区分，当前尚未见基于类似原理的DAdV-3和DAdV-A的鉴别诊断的引物和酶的报道，本研究可填补相关研究领域空白。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供提供用于鉴别DAdV-3和DAdV-A的引物和酶及其应用，建立一种仅需2条引物即可DAdV-3和DAdV-A进行同时扩增，但在扩增区域存在SalⅠ酶多态性差异（即PCR扩增区域存在SalⅠ酶酶切位点差异），对酶切产物进行常规琼脂糖凝胶电泳即可有效区分。为实现上述目的采用以下技术方案：一组用于鉴别DAdV-3和DAdV-A的引物和酶，所述引物如下：DAdV-3A-F1：5’-CATACMGYGGMACAGCTTACAATC-3’，DAdV-3A-R1：5’-ATCSCKAAAACCWATGTAGTTA-3’；所述酶为SalⅠ酶。本专利技术的另一目的是提供一种用于检测DAdV-3和DAdV-A的试剂盒，包括所述的引物和酶。按照DreamTaqGreenPCRMasterMix(2×)试剂盒推荐的的50μL体系进行扩增，其中2×PCRMasterMix扩增反应液25μL、10μM引物DAdV-3A-F1和DAdV-3A-R1分别为1.0μL、提取的核酸模板（DAdV-3、DAdV-A）各1.0μL、补充灭菌去离子水至终体积50μL，混匀后进行PCR扩增。扩增条件为95℃预变性3min后进入循环，95℃变性30s、△T（52℃-62℃）退火30s、72℃延伸35s，40个循环结束后，72℃终延伸10min，反应结束后按照常规琼脂糖凝胶电泳鉴定。△T（52℃-62℃）表示退火温度在此区间进行优化。经优化后的最佳退火温度为56℃。本专利技术的优点在于：本专利技术基于DAdV-3和DAdV-A的Hexon基因保守区核苷酸序列特征，建立一种仅需2条引物即可DAdV-3和DAdV-A进行同时扩增，但在扩增区域存在SalⅠ酶多态性差异（即PCR扩增区域存在SalⅠ酶酶切位点差异），对酶切产物进行常规琼脂糖凝胶电泳即可有效区分。该方法的敏感性和PCR相当，仅仅只需对PCR产物进行额外10min酶切后再本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一组用于鉴别DAdV‑3和DAdV‑A的引物和酶，其特征在于：所述引物如下：DAdV‑3A‑F1：5’‑CATACMGYGGMACAGCTTACAATC‑3’，DAdV‑3A‑R1：5’‑ATCSCKAAAACCWATGTAGTTA‑3’；所述酶为SalⅠ酶。

【技术特征摘要】
1.一组用于鉴别DAdV-3和DAdV-A的引物和酶，其特征在于：所述引物如下：DAdV-3A-F1：5’-CATACMGYGGMACAGCTTACAATC-3’，DAdV-3A-R1...

【专利技术属性】
技术研发人员：万春和，黄瑜，程龙飞，陈翠腾，傅光华，施少华，陈红梅，傅秋玲，刘荣昌，
申请(专利权)人：福建省农业科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：福建,35