引物、引物组合、试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，特别涉及引物、引物组合、试剂盒及其应用。本发明专利技术利用多种混合引物一次数字微滴定量PCR(digital droplet PCR)在cDNA水平上特异性检出至少17种NPM1突变。主要针对AML治疗后微小残留病变的检测，也可用于初诊患者鉴定有无NPM1突变。

Primers, primer combinations, kits and their applications

The invention relates to the field of biotechnology, in particular to primers, primer combinations, kits and their applications. The present invention detects at least 17 NPM1 mutations specifically at the level of DNA by using multiple mixed primers one-time digital droplet quantitative PCR (digital droplet PCR). The detection of minimal residual lesions after AML treatment can also be used to identify NPM1 mutations in newly diagnosed patients.

【技术实现步骤摘要】
引物、引物组合、试剂盒及其应用
本专利技术涉及生物
，特别涉及引物、引物组合、试剂盒及其应用。
技术介绍
微小残留病变(MRD)是指血液系统肿瘤在接受治疗后获得组织形态学缓解，无临床症状但仍然存在在体内的亚显微镜病变。目前临床多用PCR和流式细胞仪进行检测。急性髓细胞白血病(AML)是成人白血病中最大一个种类，约占50％-70％，是重要的致死性疾病。近年来随着治疗方法的不断改进，获得形态学缓解的患者比率越来越高，但大部分病人在获得缓解后仍然复发。了解获得显微镜下的形态学缓解患者体内是否存在肿瘤细胞，进而决定是否需要进一步治疗，是预防复发的关键步骤。然而，由于AML的异质性，对于缓解期的AML患者进行MRD检测没有统一的方法。最常用的方法是利用AML细胞中的融合基因进行检测。但所有融合基因(如PML-RARA,AML1-ETO)阳性的患者加在一起占AML的比率为30％，大多数AML没有特异性的融合基因。其它基因突变是否可以作为AML跟踪的标志一直存在争论，因为一些突变(如DNMT3A)在获得长期缓解的患者的骨髓细胞中仍然存在。另外，做为MRD跟踪的标志也需在AML患者中有一定的阳性频率。至2016年后，NPM1被公认为少数几个可做为AMLMRD跟踪的标志，因为它在AML患者肿瘤细胞中持续存在，且在长期缓解患者中检出率很低，NPM1突变阳性患者占到AML的30％，是AML中主要的基因突变形式。特别是在占AML一半以上的染色体核型正常患者中，NPM1突变可达50％-70％，而这类患者肿瘤细胞没有其它很好的生物标记。NPM1基因存在于5号染色体上，定位于5q35.1。参与DNA修复和细胞周期等多种重要生命活动。NPM1突变主要发生在急性髓细胞性白血病中，至少有27种突变(见图1，图2)。它集中在第12外显子，位点在956至971之间，为1到2个四联核苷酸插入或4-5个核苷酸缺失伴随9个核苷酸插入。它导致错义突变，从而缩短阅读框，使DNA结合区失去功能。目前临床上有多种检测NPM1突变的方法，主要目的均集中在发现初诊或复发白血病患者中是否有NPM1突变。方法包括PCR后一代(Sanger)测序和普通荧光定量PCR。PCR后一代(Sanger)测序方法存在灵敏度问题。由于白血病细胞中的NPM1突变是杂合子，即便样品中100％是白血病细胞PCR后测序阅读结果也不特别清晰，正常和突变碱基交织在一起(见图3(A)～图3(C)和图4)。当整个样本中的白血病细胞在10％时，几乎就看不出突变。而在白血病患者中，外周血中白血病细胞少于30％并不少见。如大部分急性早幼粒白血病(APL)患者。因此，PCR后Sanger测序方法对NPM1突变的检测甚至不能用于初诊患者的外周血。至于包含了针对A、B、D三个主要突变的的普通荧光定量PCR法则较繁琐且适用面窄。因为它要同时做三个荧光定量PCR，且一旦突变不在三种(而是其它几十种中的一种，约占15％-20％NPM1突变)之内，则结果为假阴性。至于微小残留病变的检测，PCR后一代(Sanger)测序方法由于灵敏度的关系当然不适合，因为初诊NPM1突变阳性的缓解期患者绝大多数细胞只含有野生型NPM1,PCR后测序结果会覆盖突变型的信号。而针对三个主要突变的的荧光定量PCR法虽也可以用于MRD检测，但它必须首先知道NPM1突变测序结果，否则如上所述会很繁琐(至少做三个独立的实验)且不可靠，因为阴性结果不能排除患者存在三种主要突变外的其它NPM1突变。另外，人们也用ASO-PCR方法进行MRD检测，即根据每个患者测序结果设计特异性的引物或探针，繁琐而昂贵。现有技术也曾尝试同时采用超过15对以上的引物混合以期一次扩增15种以上突变。但实际操作发现由于多种引物之间的干扰等因素，产生的非特异性扩增严重影响扩增的灵敏度和特异性。因此，这一检测的关键是用尽可能少的引物组合扩增出尽可能多的突变类型，同时保证PCR扩增的灵敏度和特异性(即引物最佳组合)。现有技术中亟需一种简捷方便、灵敏性高、特异性强、检出结果可靠的NPM1检测方法。
技术实现思路
针对上述现有技术中的缺陷，本专利技术提供了引物及其组合、试剂盒及其应用。本专利技术利用少数几种混合引物一次定量PCR在cDNA水平上特异性检出至少17种NPM1突变。主要针对AML治疗后微小残留病变的检测，也可用于初诊患者鉴定有无NPM1突变。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种ddPCR(digitaldropletPCR)检测试剂盒，包含如下引物：顺向通用引物，序列如SEQIDNO:7所示；逆向引物，序列如SEQIDNO:2～6所示。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述试剂盒进一步包括对照引物组，所述对照引物序列如SEQIDNO:8和9所示。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述试剂盒进一步包括探针和可接受的试剂，所述探针的序列如SEQIDNO:10和11所示。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述试剂盒中所述顺向通用引物的浓度为20～40pmol/μl，所述逆向引物的浓度分别为4～8pmol/μl，所述对照引物的浓度分别为4～8pmol/μl，所述探针的浓度分别为4～8pmol/μl。本专利技术还提供了引物组在ddPCR检测NPM1基因或其突变中的应用以及在制备检测急性髓细胞白血病、急性髓细胞白血病治疗后的微小残留病变，以及初诊患者鉴定有无NPM1突变的ddPCR试剂盒中的应用，所述引物组包括以下引物：顺向通用引物：序列如SEQIDNO:7所示的核苷酸序列；逆向引物：序列如SEQIDNO:2～6所示的核苷酸序列。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述应用中的引物组进一步包括对照有引物组，所述对照引物序列如SEQIDNO:8和9所示。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述应用中进一步包括探针及可接受的试剂，所述探针具有如SEQIDNO:10和11所示的核苷酸序列。本专利技术还提供了一种基于ddPCR检测NPM1突变的方法，包括如下步骤：步骤1：获得待测样本的核苷酸；步骤2：取所述核苷酸，与本专利技术提供的所述试剂盒中的试剂混合，扩增，根据扩增结果获得检测结果。本专利技术提供了引物，具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：Ⅰ、具有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列；Ⅱ、具有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；III、与SEQIDNO:1所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；IV、如Ⅰ、Ⅱ或III所示序列的互补序列。在本专利技术的一些具体实施方案中，如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列为：NCNTCCNCNNCNNNNNNNNNNN；其中，N(1)＝AorT；N(3)＝TorC；N(7)＝AorT；N(9)＝TorC；N(10)＝AorG；N(12)＝TorC；N(13)＝AorG；N(14)＝AorTorCorG；N(15)＝CorG；N(16)＝AorC；N(17)＝AorTorG；N(18)＝AorG；N(19)＝AorC；N(20)＝Aor*orG；N(21)＝*orG；N(22)＝*orA。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述引物具有SEQIDNO:2～6任意一项所示的核苷酸序列。在本专利技术的一些具体实施方案中，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种ddPCR(digitaldropletPCR)检测试剂盒，其特征在于，包含如下引物：顺向通用引物，序列如SEQ ID NO:7所示；逆向引物，序列如SEQ ID NO:2～6所示。

【技术特征摘要】
1.一种ddPCR(digitaldropletPCR)检测试剂盒，其特征在于，包含如下引物：顺向通用引物，序列如SEQIDNO:7所示；逆向引物，序列如SEQIDNO:2～6所示。2.权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，进一步包括对照引物组，所述对照引物序列如SEQIDNO:8和9所示。3.权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，进一步包括探针和可接受的试剂，所述探针的序列如SEQIDNO:10和11所示。4.权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述顺向通用引物的浓度为20～40pmol/μl，所述逆向引物的浓度分别为4～8pmol/μl，所述对照引物的浓度分别为4～8pmol/μl，所述探针的浓度分别为4～8pmol/μl。5.引物组在ddPCR检测NPM1基因或其突变中的应用以及在...

【专利技术属性】
技术研发人员：王阳，刘进，马冉冉，崔欢喜，任用，
申请(专利权)人：南京先声医学检验有限公司，江苏先声医学诊断有限公司，北京先声医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32