一种PF1022A分离纯化的方法技术

本发明专利技术提供了一种PF1022A分离纯化的方法。该方法包括如下步骤：从含PF1022A的发酵液中收集菌渣；将丙酮与菌渣混合，萃取、过滤，得提取液1，浓缩，得提取液2；将提取液2上样大孔树脂，预洗脱后，洗脱，收集活性部位，得含PF1022A的洗脱液，将其浓缩至除去有机溶剂，得含PF1022A的浓缩液；将含PF1022A的浓缩液用乙酸乙酯萃取后，得有机相和水相，将所得有机相浓缩、结晶即可；大孔树脂为H‑60反相吸附树脂和/或HB‑60反相吸附树脂。该方法操作简便、成本低、所用溶剂毒性较小、大孔树脂可反复使用、产物检测方法简单，适于工业化生产，所得PF1022A的收率可达70％，纯度可达91％以上。

【技术实现步骤摘要】
一种PF1022A分离纯化的方法
本专利技术涉及一种PF1022A分离纯化的方法。
技术介绍
PF1022A(结构式见式1)是一种不产孢子的半知菌无孢霉菌(Roselliniasp.)发酵产生的环缩肽类化合物，对动物低毒、驱虫普广、效果好，是合成新型兽药emodepside(结构式见式2)的关键中间体。目前PF1022A主要通过发酵半知菌无孢霉菌获得。PF1022A作为生产emodepside的关键中间体，其分离纯化报道较少。PF1022A呈弱极性，可溶于甲醇、乙酸乙酯、丙酮等有机溶剂，难溶于水。文献“Anewanthelminticcyclodepsipeptide，PF1022”(THEJOURNALOFANTIBIOTICS，1992，45(5)：692-697)报道了一种PF1022A分离纯化的方法，该方法首先利用乙酸乙酯提取出菌体中的产物，萃取液进行浓缩后用氯仿溶解，然后用硅胶柱进行分离层析，以氯仿和甲醇的混合物作为洗脱剂进行洗脱。但是氯仿具有致癌性，硅胶柱不可重复使用，产物的检测方法繁琐，不利于产业化生产。因此有必要改进PF1022A的分离纯化方法。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是为了克服现有技术中PF1022A提取时溶剂毒性大、硅胶柱不可重复利用以及产物的检测方法繁琐的缺陷，而提供一种PF1022A分离纯化的方法，该方法操作简便、成本低、所用溶剂的毒性较小、大孔树脂可反复使用、产物检测方法简单，收率可达70％，适于工业化生产，所得PF1022A的纯度可达91％以上。本专利技术提供了一种PF1022A分离纯化的方法，其包括如下步骤：(1)从含PF1022A的发酵液中收集菌渣；(2)将丙酮与所述菌渣混合，进行萃取，过滤，得提取液1，然后浓缩，得提取液2；(3)将所得提取液2上样大孔树脂，预洗脱除杂后，进行洗脱，收集活性部位，得含PF1022A的洗脱液，并将其浓缩至除去有机溶剂，得含PF1022A的浓缩液；(4)将含PF1022A的浓缩液用乙酸乙酯萃取后，得有机相和水相，将所得有机相浓缩、结晶即可；所述大孔树脂为H-60反相吸附树脂和/或HB-60反相吸附树脂。本专利技术中，含PF1022A的发酵液为本领域常规，一般由半知菌无孢霉菌经过本领域常规方法发酵获得，常规能够生产PF1022A的菌株均可使用，如半知菌无孢霉菌NBRC-33096(购于日本技术评价研究所生物资源中心)，本领域常规的含PF1022A的发酵液均适用于本专利技术的方法。在本专利技术的一较佳实施例中，所述含PF1022A的发酵液由半知菌无孢霉菌(Roselliniasp.)NBRC-33096(购于日本技术评价研究所生物资源中心)发酵培养获得，步骤包括：(1)将所述半知菌无孢霉菌NBRC-33096接种于斜面培养中，在26℃下培养6天；(2)将菌丝进行种子培养，在26℃及摇床转速200rpm下，培养4天；(3)在26℃及摇床转速200rpm下，发酵培养7天后即可；其中，所述斜面培养的培养基包含下述浓度的各组分：马铃薯葡萄糖琼脂40.0g/L和琼脂5.0g/L；所述种子培养的培养基包含下述浓度的各组分：葡萄糖10.0g/L、可溶性淀粉20.0g/L、酵母提取物3.0g/L、聚蛋白胨5g/L、麦芽浸粉6.0g/L、热榨黄豆饼粉2.0g/L和CaCO32.0g/L，且所述种子培养的培养基的初始pH值为6.0；所述发酵培养的培养基包含下述浓度的各组分：葡萄糖20.0g/L、可溶性淀粉50.0g/L、酵母提取物3.8g/L、麦芽浸粉8.0g/L、热榨黄豆饼粉13.0g/L、CaCO32.0g/L和NaCl1.3g/L，且所述发酵培养的培养基的初始pH值为6.0。步骤(1)中，所述收集菌渣的操作为本领域常规的预处理操作，较佳地为离心或板框过滤。步骤(2)中，所述丙酮的体积与所述菌渣的质量比较佳地为2:1，单位为L/g，所述萃取的时间较佳地为2h，所述萃取过程中一般会不断搅拌，使菌体处于悬浮状态，以充分提取细胞内的产物。步骤(2)中，所述菌渣的萃取次数较佳地为2-3次。步骤(2)中，所述浓缩为本领域常规操作，一般采用旋转蒸发仪，所述浓缩的温度较佳地为35℃，所述提取液2中丙酮浓度较佳地为40％-50％，更佳地为45％-48％，所述百分比为体积百分比。步骤(3)中，所述预洗脱采用的预洗脱液一般为有机溶剂水溶液，所述有机溶剂水溶液的浓度较佳地为45％～65％，更佳地为55％～63％，所述百分比为体积百分比。所述有机溶剂水溶液较佳地为甲醇水溶液、乙醇水溶液或丙酮水溶液，更佳地为甲醇水溶液或丙酮水溶液。对于所述H-60反相吸附树脂，所述甲醇水溶液的浓度较佳地为55％～63％，所述百分比为体积百分比。所述乙醇水溶液的浓度较佳地为55％～58％，所述百分比为体积百分比。所述丙酮水溶液的浓度较佳地为53％～63％，所述百分比为体积百分比。对于所述HB-60反相吸附树脂，所述甲醇水溶液的浓度较佳地为48％～63％，所述百分比为体积百分比。所述乙醇水溶液的浓度较佳地为45％～65％，所述百分比为体积百分比。所述丙酮水溶液的浓度较佳地为53％～65％，所述百分比为体积百分比。步骤(3)中，所述预洗脱所采用的所述有机溶剂水溶液的体积较佳地为2～4CV，所述CV为本领域常规计量术语，全称为树脂柱体积，英文名columnvolume。步骤(3)中，所述洗脱采用的洗脱液一般为有机溶剂水溶液，所述有机溶剂水溶液的浓度较佳地为50％～75％，更佳地为55％～70％，所述百分比为体积百分比。所述有机溶剂水溶液较佳地为甲醇水溶液、乙醇水溶液或丙酮水溶液，更佳地为甲醇水溶液或丙酮水溶液。对于所述H-60反相吸附树脂，所述甲醇水溶液的浓度较佳地为63％～72％，所述百分比为体积百分比。所述乙醇水溶液的浓度较佳地为63％～75％，所述百分比为体积百分比。所述丙酮水溶液的浓度较佳地为60％～70％，所述百分比为体积百分比。对于所述HB-60反相吸附树脂，所述甲醇水溶液的浓度较佳地为55％～75％，所述百分比为体积百分比。所述乙醇水溶液的浓度较佳地为50％～73％，所述百分比为体积百分比。所述丙酮水溶液的浓度较佳地为60％～70％，所述百分比为体积百分比。步骤(3)中，所述洗脱所采用的所述有机溶剂水溶液的体积较佳地为2～4CV，所述CV为本领域常规计量术语，全称为树脂柱体积，英文名columnvolume。步骤(3)中，所述活性部位的收集一般按照本领域常规方法经过HPLC检测后收集。所述活性部位的PF1022A的HPLC纯度较佳地为≥85％，所述PF1022A的HPLC纯度的检测方法可按照本领域常规，即通过高效液相色谱检测确定。所述高效液相色谱的监测条件如下：色谱柱为HypersilC18柱(4.6mm×150mm，5μm)；流动相为乙腈：水＝80:20(体积比)；流速为1mL/min；柱温为30℃；检测波长为220nm；进样量为20μL。步骤(3)中，所述浓缩的温度较佳地为30～45℃，更佳地为35～40℃，最佳地为35℃。步骤(4)中，所述乙酸乙酯与所述含PF1022A的浓缩液的体积比较佳地为(0.5～4):1，更佳地为(2～3):1，最佳地为2:1。步骤(4)中，所述水相较佳地用乙本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种PF1022A分离纯化的方法，其特征在于，其包括如下步骤：(1)从含PF1022A的发酵液中收集菌渣；(2)将丙酮与所述菌渣混合，进行萃取，过滤，得提取液1，然后浓缩，得提取液2；(3)将所得提取液2上样大孔树脂，预洗脱除杂后，进行洗脱，收集活性部位，得含PF1022A的洗脱液，并将其浓缩至除去有机溶剂，得含PF1022A的浓缩液；(4)将含PF1022A的浓缩液用乙酸乙酯萃取后，得有机相和水相，将所得有机相浓缩、结晶即可；所述大孔树脂为H‑60反相吸附树脂和/或HB‑60反相吸附树脂。

【技术特征摘要】
1.一种PF1022A分离纯化的方法，其特征在于，其包括如下步骤：(1)从含PF1022A的发酵液中收集菌渣；(2)将丙酮与所述菌渣混合，进行萃取，过滤，得提取液1，然后浓缩，得提取液2；(3)将所得提取液2上样大孔树脂，预洗脱除杂后，进行洗脱，收集活性部位，得含PF1022A的洗脱液，并将其浓缩至除去有机溶剂，得含PF1022A的浓缩液；(4)将含PF1022A的浓缩液用乙酸乙酯萃取后，得有机相和水相，将所得有机相浓缩、结晶即可；所述大孔树脂为H-60反相吸附树脂和/或HB-60反相吸附树脂。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述含PF1022A的发酵液由半知菌无孢霉菌(Roselliniasp.)NBRC-33096发酵培养获得，步骤包括：(1)将所述半知菌无孢霉菌NBRC-33096接种于斜面培养中，在26℃下培养6天；(2)将菌丝进行种子培养，在26℃及摇床转速200rpm下，培养4天；(3)在26℃及摇床转速200rpm下，发酵培养7天后即可；其中，所述斜面培养的培养基包含下述浓度的各组分：马铃薯葡萄糖琼脂40.0g/L和琼脂5.0g/L；所述种子培养的培养基包含下述浓度的各组分：葡萄糖10.0g/L、可溶性淀粉20.0g/L、酵母提取物3.0g/L、聚蛋白胨5g/L、麦芽浸粉6.0g/L、热榨黄豆饼粉2.0g/L和CaCO32.0g/L，且所述种子培养的培养基的初始pH值为6.0；所述发酵培养的培养基包含下述浓度的各组分：葡萄糖20.0g/L、可溶性淀粉50.0g/L、酵母提取物3.8g/L、麦芽浸粉8.0g/L、热榨黄豆饼粉13.0g/L、CaCO32.0g/L和NaCl1.3g/L，且所述发酵培养的培养基的初始pH值为6.0。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述丙酮的体积与所述菌渣的质量比为2:1，单位为L/g，所述萃取的时间为2h；所述菌渣的萃取次数为2-3次。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述浓缩的温度为35℃，所述提取液2中丙酮浓度为40％-50％，较佳地为45％-48％，所述百分比为体积百分比。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述预洗脱采用的预洗脱液为有机溶剂的水溶液...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈少欣，刘瑞，马巧慧，
申请(专利权)人：上海医药工业研究院，中国医药工业研究总院，
类型：发明
国别省市：上海,31