本发明专利技术公开了一种掌叶半夏胰蛋白酶抑制剂基因、其编码的蛋白及抗虫应用。基因的核苷酸序列表如SEQ ID NO：1所示。在培育耐抗虫转基因植物时，首先构建含有SEQ ID NO：1所示基因的重组表达载体，然后利用所得重组表达载体构建转化体，再利用所得转化体转化目的植物，筛选阳性植株，经过三代筛选得到纯合的与正常植物相比具有抗虫性的转基因植物。发明专利技术人通过大量科学研究证明本发明专利技术的基因对植物的抗虫特性具有明显的提升作用，证明其与植物的抗虫性具有紧密联系，基于此并利用现有基因工程方法得到了具有高抗虫性的转基因植物，对减少农药防治蚜虫、提高作物种植效率和种植产量具有重大的实际意义。
A Pinellia palmata trypsin inhibitor gene, its encoded protein and insect resistant application
The invention discloses a trypsin inhibitor gene of Pinellia ternata, a protein encoded by the gene and an insect-resistant application thereof. The nucleotide sequence of the gene is shown in SEQ ID NO:1. In the breeding of insect-resistant transgenic plants, the recombinant expression vector containing SEQ ID NO:1 gene was constructed first, then the transformants were constructed by using the recombinant expression vector. Then the transformants were used to transform the target plants, and the positive plants were screened. After three generations of screening, the homozygous plants were found to be insect-resistant compared with the normal plants. Transgenic plants. Inventors have proved through a large number of scientific research that the gene of the invention can obviously enhance the insect resistance of plants, and prove that the gene of the invention is closely related to the insect resistance of plants. Based on this and using the existing genetic engineering methods, transgenic plants with high insect resistance are obtained, which can reduce pesticide control aphids and improve crop species. Planting efficiency and planting yield are of great practical significance.
【技术实现步骤摘要】
一种掌叶半夏胰蛋白酶抑制剂基因、其编码的蛋白及抗虫应用
本专利技术涉及基因工程
，尤其是一种与掌叶半夏蛋白酶抑制剂基因的制备、编码的蛋白及其在抗虫相关中的应用。
技术介绍
蚜虫是繁殖最快的昆虫，在地球上危害作物广泛，且因发展出了多种自我保护的防御方式很难防治，有的种类能够分泌植物激素，使得植物形成瘿瘤巢；有的分泌一层蜡质覆盖于体表令药物难于渗入；有的释放强烈芥末油气味吓跑天敌。蚜虫还是农业上很多病害的传播媒体,棉蚜分泌物是人类呼吸道重要过敏源，严重破坏城乡生活环境。掌叶半夏（Pinelliapedatisecta）是一种具天然抗虫特性的中草药。化学成分主要包括生物碱类及脂肪酸类和凝集素类、蛋白质等，总蛋白成分对麦长管蚜、禾缢管蚜、棉蚜和桃蚜等刺吸口器害虫有致死活性。在农作物上利用这一特性采用生物技术的方法改良提高其对蚜虫抗性。国内外研究现状与发展动态综述如下。⑴目前克隆的抗蚜基因少。抗蚜资源多存在于野生种或近源种中，在3500个大豆种质中仅筛选到11个抗源；在1200个莴苣种质中筛选到2个抗源；4万个小麦资源中，仅300个表现抗性。植物对昆虫的抗性一般可分为3种类型,即驱避性、抗生性和耐害性，其中抗性作用最明显，包括多基因控制和单显（隐）基因控制，如小麦对麦双尾蚜（DiuraphisnoxiaMordvilko)的抗性、大豆对大豆蚜（AphisglycinesMatsumura）的抗性是单显基因控制；但在小麦、大麦中也发现了用于对豌豆蚜（AcythosiphonpisumHarris）、玉米蚜（RhopalosiphummaidisFitch）的隐性抗蚜基因，数量性状控制的抗性更多。理论上只有单显基因控制的抗性有利于通过基因克隆和转化应用于其他物种上，更多的资源适用于本作物的远源杂交或常规育种。随着植物基因组学和功能基因组学的发展,一些抗蚜基因被克隆出来，如：野生番茄Mi-1基因可抗大戟长管蚜（Macrosiphumeuphorbiae），另一个Vat基因可抗甜瓜棉蚜（AphisgossypiiGlover），这类抗蚜基因一般与植物超敏反应有关，即对应植物能识别被蚜虫入侵的信号，以合成酚类物质、在细胞壁上沉积胼胝质、木质素等方式对抗蚜虫。虽已有抗蚜基因被克隆，但因为蚜虫的种类很多，一种基因可抗的蚜虫种类过少，远不能满足作物抗虫的需要。⑵掌叶半夏抗蚜资源的优势。掌叶半夏是一种天然高抗蚜、无特殊味道的中草药，从90年代起人们开始分离半夏的抗虫活性物质，开始认为主要作用是由植物凝集素形成的，先后从掌叶半夏中克隆出了PPA-1、PTA-1等多个基因，在抗蚜虫方面具有一定的意应用价值。此外，2010年范汉东等人从半夏块茎总蛋白鉴定出一种新的抗蚜活性物质，即植物胰蛋白酶抑制剂（Pinelliapeatisectatrypsininhibitor，以下称PPTI蛋白或PPTI基因）类型的抗蚜虫蛋白：当其浓度达到0.5%时，5天后蚜虫的校正死亡率达到100%。更重要的是经SDS-PAGE、反相高效液相色谱测算该物质为不含糖的纯蛋白，质谱分析显示其相对分子量为20596.09。PPTI蛋白与其它种类抗虫活性蛋白相比具有以下优点：首先，它是纯蛋白质作用的结果，相较于依赖与糖结合的凝聚素家族，基因更容易构建转化载体，应用植物范围广；其次，蛋白酶抑制剂一般具有更广谱的抗虫性，因此推测PPTI对多种蚜虫会有抗性；第三，昆虫不易产生对蛋白抑制剂的耐受性。我们进一步研究发现在掌叶半夏叶片部位可由机械损伤和病虫侵入诱导高浓度表达此类蛋白。⑶蛋白酶抑制剂的抗虫及其特性。以往学者对此已有很多研究，如：达克东等、杜国强等系统研究了用豇豆CpTI基因转化苹果，60个转化株系中有2个对棉铃虫的抗性达到100%；王浩华等研究了虫害诱导杨树胰蛋白酶KTI基因过量表达情况，明确了杨树KTI基因家族的功能多样性及其抗病抗虫作用。徐平丽等从小麦中克隆到一个BBI型蛋白酶抑制剂TaUES基因，并证明其参与了盐和干旱胁迫应答。在植物中目前已经发现有三大类蛋白酶抑制剂:丝氨酸、琉基和金属蛋白酶抑制剂，本专利技术申请的PPTI蛋白属于第一类及丝氨酸蛋白酶抑制剂，丝氨酸蛋白酶抑制剂也已至少经发现有6个家族，但只有部分成员具有较强抗性功能，除了以上几个以外，还有弧豆、马铃薯的蛋白酶抑制剂等，但已发现的蛋白酶抑制剂对抗逆境种类和作用效果差异千差万别，现有毒性的蛋白酶抑制剂基因搭配组成型启动子的转基因植物，其蛋白酶抑制剂表达量仍然较低，一般达不到蚜虫的致死剂量。综上，抗蚜基础研究从国内外研究现状来看，存在问题包括：一是，作物对蚜虫的抗性基因研究还很少，可用广谱的单抗生性基因很少；二是，广谱的植物凝集素因大多含有糖链，而用基因工程的方法很难表达正确的糖链；三是，现有蛋白酶抑制剂基因搭配组成型启动子的转基因植物，一般达不到致死剂量，开发有效的无公害防治蚜虫的蛋白酶抑制剂基因具有十分重要的意义。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有技术中的不足，提供一种掌叶半夏胰蛋白酶抑制剂基因、其编码的蛋白及抗虫应用。为解决上述技术问题，本专利技术所采取的技术方案如下。一种与植物抗虫性相关的基因，其核苷酸序列表如SEQIDNO：1所示。本专利技术还包括含有上述基因的重组表达载体。本专利技术还包括含有上述基因的核基因组转化体。本专利技术还包括上述基因的扩增引物对。本专利技术还包括上述述基因编码的蛋白。本专利技术还包括上述上述基因在培育耐抗虫转基因植物中的应用。首先构建含有SEQIDNO：1所示基因的重组表达载体，然后利用所得重组表达载体构建转化体，再利用所得转化体转化目的植物，筛选阳性植株，经过三代筛选得到纯合的与正常植物相比具有抗虫性的转基因植物。所述目的植物为烟草。所述抗虫性主要是指针对同翅目昆虫的抗性。采用上述技术方案所产生的有益效果在于：专利技术人通过大量科学研究证明本专利技术的基因对植物的抗虫特性具有明显的提升作用，证明其与植物的抗虫性具有紧密联系，基于此，利用现有基因工程方法得到了具有高抗虫性的转基因植物，对减少农药防治蚜虫、提高作物种植效率和种植产量具有重大的实际意义。本专利技术详细的有益效果分述如下。⑴、通过3端RACE和5端DNA步移技术获得了一个全长的掌叶半夏胰蛋白酶抑制因子PPTI基因序列。PPTI基因全长642bp，编码214个氨基酸，分子量为23kD，pI值为5.13；信号肽由N端19个氨基酸残基组成，具有STI（大豆蛋白酶抑制剂）结构域，为一种的胰蛋白酶抑制因子。蛋白跨膜域预测结果：inside线与outside线始终不曾交叉，因此认为该蛋白不具有跨膜域。蛋白亲疏水性在线分析：肽链主体部分大多分布于疏水区，只有少部分分布在亲水区，该蛋白属于脂溶性蛋白。⑵、对该基因进行转化烟草的功能验证。不同的转基因植株抗虫性差异很大，从接虫后第15天结果来看，10种转基因烟草对烟蚜的种群抑制力由大到小为7、1、3、5、9、8、2、6、4、10；其中7号和1号对烟蚜的种群抑制率最高分别达到了100%和92.02%，3号植株的抑制率也较高为78.85%，5号的抑制率也分别为58.84%，其余的转基因植株并不表现抗性，这可能与转基因沉默导致转基因不表达引起的。尤其是7号转基因植株在接种7天后烟蚜全部死本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种掌叶半夏胰蛋白酶抑制剂基因，其特征在于：其核苷酸序列表如SEQ ID NO：1所示。
【技术特征摘要】
1.一种掌叶半夏胰蛋白酶抑制剂基因，其特征在于：其核苷酸序列表如SEQIDNO：1所示。2.含有权利要求1所述基因的重组表达载体。3.含有权利要求1所述基因的核转化体。4.扩增权利要求1所述基因的引物对。5.权利要求1所述基因编码的蛋白。6.权利要求1所述的基因在培育耐抗虫转基因植物中的应用。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：首先...
【专利技术属性】
技术研发人员：董文琦，吴志明，高俊平，田哲娟，蒲娜娜，党红凯，李亚栋，
申请(专利权)人：河北省农林科学院，
类型：发明
国别省市：河北,13
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