一种诱导人间充质干细胞向血管内皮细胞分化的方法技术

一种诱导人间充质干细胞向血管内皮细胞分化的方法，包括：S1：人内皮细胞株水浴复苏、接种、培养；S2：细胞培养2天后，进行全量换液，并收集细胞培养上清，置于4℃保存；S3：分离纯化人骨髓和皮肤间充质干细胞，并传至第三代，收集；S4：取出步骤S2中4℃保存的人内皮细胞株培养上清液，1000转/分离心10分钟；收集上清，并按照1:1的体积比与新鲜的DMEM/F12培养基充分混合；S5：用混合的培养基重悬第三代骨髓和皮肤间充质干细胞，并接种于细胞培养板中，然后置于5％(体积)CO2、37℃培养箱中培养，隔日采用混合的培养基进行换液；S6：监控分化过程、鉴定分化情况，获得所需的血管内皮细胞。

A method of inducing human mesenchymal stem cells to differentiate into vascular endothelial cells

A method of inducing human mesenchymal stem cells to differentiate into vascular endothelial cells includes: S1: resuscitation, inoculation and culture of human endothelial cells in water bath; S2: full fluid exchange after 2 days of cell culture and cell culture supernatant collection and storage at 4 C; S3: isolation and purification of human bone marrow and skin mesenchymal stem cells, and transfer to The third generation, collection; S4: take out the culture supernatant of human endothelial cell lines stored at 42 4 C for 10 minutes, 1000 turns / heart separation; collect the supernatant and mix it with fresh DMEM / F12 medium according to the volume ratio of 1:1; S5: suspend the third generation of bone marrow and skin mesenchymal stem cells with mixed medium and inoculate them Culturing plate, then placed in 5% (volume) CO2, 37 C incubator culture, the next day using mixed media for fluid exchange; S6: monitoring the differentiation process, identification of differentiation, to obtain the required vascular endothelial cells.

【技术实现步骤摘要】
一种诱导人间充质干细胞向血管内皮细胞分化的方法
本专利技术涉及细胞诱导、分化
，尤其涉及干细胞诱导、分化
，具体涉及一种诱导人间充质干细胞向血管内皮细胞分化的方法。
技术介绍
心脑血管疾病、动脉粥样硬化、银屑病、肿瘤及系统性红斑狼疮均是危害人类健康的重大疾病。血管改变在以上疾病的发病中扮演着重要的角色。血管内皮细胞分化机理的研究不仅是血管相关疾病发病机理研究的关键点，更是以血管内皮细胞为基础进行细胞治疗的首要环节。间充质干细胞体外分化的血管内皮细胞是细胞治疗血管性疾病的理想来源。目前国际上报道将间充质干细胞体外分化为血管内皮细胞的方法较多，包括在培养基中添加血管内皮生长因子、骨形态发生蛋白-4等因子及低氧环境、明胶包被培养板诱导分化等方法。但是我们在体外将间充质干细胞分化为血管内皮细胞的实验中发现，采用添加血管内皮生长因子、骨形态发生蛋白-4、低氧、明胶包被培养板等方法均不能很好的将间充质干细胞体外分化为血管内皮细胞。而且血管内皮生长因子、骨形态发生蛋白-4等因子与耗材价格昂贵，不适合大规模的进行生产化体外获得血管内皮细胞，限制了细胞治疗临床应用的发展。基于传统报道技术难以使间充质干细胞定向分化为血管内皮细胞，需要一种新的诱导分化的方法。而我们实验室在使用传统方法无法成功诱导分化后，通过内皮细胞培养上清诱导分化取得成功。
技术实现思路
鉴于现有技术中存在的问题，本专利技术的目的之一在于提出一种全新的诱导人间充质干细胞向血管内皮细胞分化的方法。为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：一种诱导人间充质干细胞向血管内皮细胞分化的方法，包括：S1：人内皮细胞株水浴复苏、接种、培养；S2：细胞培养2天后，进行全量换液，并收集细胞培养上清，置于4℃保存。S3：分离纯化人骨髓和皮肤间充质干细胞，并传至第三代，收集；S4：取出步骤S2中4℃保存的人内皮细胞株培养上清液，1000转/分离心10分钟；收集上清，并按照1:1的体积比与新鲜的DMEM/F12培养基充分混合；S5：用混合的培养基重悬第三代骨髓和皮肤间充质干细胞，并接种于细胞培养板中，然后置于5％(体积)CO2、37℃培养箱中培养，隔日采用混合的培养基进行换液；S6：监控分化过程、鉴定分化情况，获得所需的血管内皮细胞。作为优选实施例，步骤S1中人内皮细胞株水浴复苏、接种、培养；所述人内皮细胞株为人内皮细胞株EA.hy926，37℃水浴复苏细胞，将其接种于含有10％(胎牛血清与DMEM/F12培养基的体积比)胎牛血清的DMEM/F12培养基中，置于5％(体积比)CO2、37℃培养箱中培养。作为优选实施例，步骤S3中分离、培养骨髓间充质干细胞的具体方法为：采用密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞，用DMEM洗涤分离的骨髓单个核细胞两次后，加入DMEM/F12，并加入10％(体积比)胎牛血清、2ng/ml(质量体积比)碱性成纤维细胞生长因子、10ng/ml(质量体积比)表皮生长因子、10ng/ml(质量体积比)胰岛素样生长因子及青链双抗，以1×104/cm2密度接种于25cm2的培养瓶内，置于37℃、5％(体积比)CO2培养箱中培养；24小时后，吸取培养液连同未贴壁细胞弃去，加入新鲜的含有生长因子的培养液，继续培养贴壁细胞，每四天更换一次培养液；在倒置相差显微镜下每天观察细胞生长情况；生长12天细胞达到近融合时采用胰酶消化贴壁细胞并传代：吸取培养液，用磷酸盐缓冲液冲洗一次，然后加入2毫升含0.25％(质量体积比，100mlPBS中含有0.25g胰蛋白酶)胰蛋白酶及0.02％(质量体积比,100ml水溶液中含有0.02g乙二胺四乙酸)乙二胺四乙酸的消化液，倒置相差显微镜下观察，待细胞变圆，部分脱落后，加入含血清的培养液，终止消化，并轻轻吹打，1000转/分离心5分钟，弃上清，DMEM洗涤一次；按照上述方法继续消化传代培养至第三代。作为优选实施例，步骤S3中分离、培养皮肤间充质干细胞的具体方法为：正常皮肤组织消毒，无菌条件下分割成约1cm3的组织块，0.25％(质量体积比)中性蛋白酶Ⅱ37℃消化2～4小时以分离真、表皮，收集真皮部分，加入含有10％(体积比)胎牛血清的DMEM/F12培养基终止消化，反复吹打组织，通过孔径40微米的细胞筛去除未消化组织，收集滤液，冰上放置30分钟，1000转/分离心10分钟，弃上清，DMEM/F12培养基重悬细胞，加入5％(体积比)胎牛血清、10g/L(质量体积比)碱性成纤维细胞生长因子、20μL/mL(体积比)B27添加物、青霉素100U/mL及链霉素100g/mL(质量体积比)，接种于T25培养瓶中，37℃、5％(体积比)CO2饱和湿度培养箱中培养。细胞培养72小时后，全量换液，弃去未贴壁的细胞，加入新鲜的含10％(体积比)胎牛血清的DMEM/F12培养液，继续培养贴壁细胞，之后每3天半量换液1次。培养72小时后，倒置相差显微镜下观察细胞生长呈长梭形或多角形，贴壁并开始呈克隆样迅速生长，14天左右达到90％融合状态，用0.25％(质量体积比)胰蛋白酶消化传代至第三代。作为优选实施例，在细胞诱导分化过程中采用倒置相差显微镜监控和鉴定间充质干细胞向血管内皮细胞的分化情况。作为优选实施例，在细胞诱导分化过程中采用流式细胞术监控和鉴定间充质干细胞向血管内皮细胞的分化情况。作为优选实施例，在细胞诱导分化过程中采用血管成形实验监控和鉴定间充质干细胞向血管内皮细胞的分化情况。作为优选实施例，在细胞诱导分化过程中采用低密度脂蛋白摄取实验监控和鉴定间充质干细胞向血管内皮细胞的分化情况。与现有技术方案相比，本专利技术至少具有以下有益效果：本专利技术获得人间充质干细胞诱导分化为血管内皮细胞过程中，还包括对血管内皮细胞的鉴定，用于鉴定血管内皮细胞的方法与以往文献报道一致：1、显微镜观察人间充质干细胞分化过程中细胞形态的变化，随着分化时间的增加，细胞形态由长梭形逐渐变短，扁平状，呈内皮细胞样；2、流式细胞术检测人间充质干细胞分化过程中，血管内皮细胞表面特异性标志CD31的表达水平，随着分化程度的不断增加，细胞表面抗原CD31的表达水平也逐渐增加；3、分化后期，进行血管成形实验，相差镜下观察细胞显示内皮细胞管腔形成清晰可见；4、分化后期进行摄取实验：红色标记为乙酰化低密度脂蛋白，蓝色标记为细胞核，激光共聚焦显微镜观察显示Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白被内皮细胞摄取，存在于细胞质中。与以往报道的血管内皮细胞体外分化方法相比较，本专利技术具有以下优点：①操作简单，只需要将血管内皮细胞株培养上清与基础培养基按照1:1的体积比混合，然后对间充质干细胞进行诱导分化，而以往报道的方法对血管内皮细胞因子、骨形成蛋白-4等分子需要进行精确的浓度控制，低氧环境需要采用特殊的培养环境，明胶板等需要提前对培养板进行复杂的处理。②分化效率高，我们的研究数据表明采用该方法诱导分化后，血管内皮细胞分化的成功率及分化效率比报道的方法高。③费用低，采用该方法进行体外诱导分化只需要购买内皮细胞株和基础细胞培养基，平均每例诱导分化试剂费用低于一千元，以往报道的分化方法因子及耗材平均每例诱导分化试剂费用在三千元以上。本专利技术在科研及临床应用中均具有重要的价值，①采用该方法进行间充质干细胞体外分化血管内皮细胞的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种诱导人间充质干细胞向血管内皮细胞分化的方法，包括：S1：人内皮细胞株水浴复苏、接种、培养；S2：细胞培养2天后，进行全量换液，并收集细胞培养上清，置于4℃保存；S3：分离纯化人骨髓和皮肤间充质干细胞，并传至第三代，收集；S4：取出步骤S2中4℃保存的人内皮细胞株培养上清液，1000转/分离心10分钟；收集上清，并按照1:1的体积比与新鲜的DMEM/F12培养基充分混合；S5：用混合的培养基重悬第三代骨髓和皮肤间充质干细胞，并接种于细胞培养板中，然后置于5％(体积比)CO2、37℃培养箱中培养，隔日采用混合的培养基进行换液；S6：监控分化过程、鉴定分化情况，获得所需的血管内皮细胞。

【技术特征摘要】
1.一种诱导人间充质干细胞向血管内皮细胞分化的方法，包括：S1：人内皮细胞株水浴复苏、接种、培养；S2：细胞培养2天后，进行全量换液，并收集细胞培养上清，置于4℃保存；S3：分离纯化人骨髓和皮肤间充质干细胞，并传至第三代，收集；S4：取出步骤S2中4℃保存的人内皮细胞株培养上清液，1000转/分离心10分钟；收集上清，并按照1:1的体积比与新鲜的DMEM/F12培养基充分混合；S5：用混合的培养基重悬第三代骨髓和皮肤间充质干细胞，并接种于细胞培养板中，然后置于5％(体积比)CO2、37℃培养箱中培养，隔日采用混合的培养基进行换液；S6：监控分化过程、鉴定分化情况，获得所需的血管内皮细胞。2.如权利要求1所述方法，步骤S1中人内皮细胞株水浴复苏、接种、培养；所述人内皮细胞株为人内皮细胞株EA.hy926，37℃水浴复苏细胞，将其接种于含有10％(体积比)胎牛血清的DMEM/F12培养基中，置于5％(体积比)CO2、37℃培养箱中培养。3.如权利要求1所述方法，步骤S3中分离、培养骨髓间充质干细胞的具体方法为：采用密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞，用DMEM洗涤分离的骨髓单个核细胞两次后，加入DMEM/F12，并加入10％(体积比)胎牛血清、2ng/ml碱性成纤维细胞生长因子、10ng/ml表皮生长因子、10ng/ml胰岛素样生长因子及青链双抗，以1×104/cm2密度接种于25cm2的培养瓶内，置于37℃、5％(体积比)CO2培养箱中培养；24小时后，吸取培养液连同未贴壁细胞弃去，加入新鲜的含有生长因子的培养液，继续培养贴壁细胞，每四天更换一次培养液；在倒置相差显微镜下每天观察细胞生长情况；生长12天细胞达到近融合时采用胰酶消化贴壁细胞并传代：吸取培养液，用磷酸盐缓冲液冲洗一次，然后加入2毫升含0.25％(质量体积比)胰蛋白酶及0.02％(质量体积比)乙二胺四乙...

【专利技术属性】
技术研发人员：张开明，李俊琴，周玲，
申请(专利权)人：太原市中心医院，
类型：发明
国别省市：山西,14