表达狂犬抗体的CHO细胞无血清悬浮培养方法技术

本发明专利技术公开了一种表达狂犬抗体的CHO细胞无血清悬浮培养方法。该方法包括细胞株的培养、细胞的收集及无血清培养基配制、培养皿的预处理、细胞培养和细胞状态的观察共4个步骤。本发明专利技术选用常用的哺乳动物细胞表达系统CHO细胞进行研究，通过改进实验的方法，确定无血清悬浮化培养的条件；采用无血清培养细胞，可以极大地降低生产成本，降低外源蛋白的污染；提高抗体蛋白的表达量，且在无血清中培养容易纯化目的蛋白，提高了生产效率。

Serum-free suspension culture of CHO cells expressing rabies antibodies

The invention discloses a CHO cell serum-free suspension culture method for expressing rabies antibody. The method includes four steps: cell culture, cell collection, preparation of serum-free medium, pretreatment of culture dish, cell culture and observation of cell status. The present invention chooses CHO cells, a common mammalian cell expression system, to study and determine the conditions of serum-free suspension culture by improving the experimental method; using serum-free culture cells, the production cost can be greatly reduced, the pollution of foreign proteins can be reduced; the expression of antibody proteins can be increased, and in serum-free medium. It is easy to purify the target protein and improve the production efficiency.

【技术实现步骤摘要】
表达狂犬抗体的CHO细胞无血清悬浮培养方法
本专利技术涉及一种表达狂犬抗体的CHO细胞无血清悬浮培养方法，以及优化的CHO细胞无血清培养基。
技术介绍
抗体工程技术随着现代生物技术的发展已经是生物技术产业化的主力军，尤其在生物技术制药领域占有重要地位。抗体是生物医学领域用途最为广泛的具有治疗肿瘤以及重大疾病的蛋白制品，而且抗体作为药物用于人类疾病的治疗拥有很长历史。目前，哺乳动物细胞在生物制品的生产中具有极其重要的应用价值，优势在于能够表达具有人源性的重组治疗性的且保持有生物活性的蛋白制品(Rodriguesetal.2013)。其中，最为典型的代表是使用中国仓鼠卵巢细胞表达抗体，CHO细胞表达系统具有大规模生产的优点，具体表现为能够高效稳定表达目的蛋白，同时具有易操作的特性。为了获得大量的抗体蛋白，中国仓鼠卵巢细胞(CHO)被多数的研究者用来表达外源蛋白，由于缺失DHFR-基因，容易筛选目的细胞株，是一种理想的表达系统(Gandoretal.1995；Junetal.2005)。随着近年来生物制品产业的兴起，CHO细胞已经被广泛用来表达抗体以及其他病毒糖蛋白制品。生物蛋白类的产品要求能够在相应的细胞中大量表达、容易纯化、成本低且外源蛋白以及可能存在的污染物蛋白要降至最低标准。传统的CHO细胞只能在含有血清的培养基中贴壁生长，严重的限制了蛋白的表达量，因为贴壁生长的细胞存在一定的限制，同时使用血清都会引入外源蛋白。血清的成分非常丰富且能够满足绝大多数细胞的生长需求，但是使用血清后，无疑增加了生产成本且很容易引入外源污染蛋白物质(Rodriguesetal.2013)，正是这些缺点要求生产生物制品的企业和研究机构迫切寻找一种可以让细胞在无血清和悬浮的状态下生长，这样就能降低外源蛋白的污染，降低成本，从而能够实现大规模生产(Chenetal.2000)。在本实验室研究的基础上，构建哺乳动物细胞CHO来表达狂犬的抗体蛋白，并且筛选了一株表达抗体蛋白的细胞株。为了克服无血清和悬浮培养的技术难题，本专利技术的实验方法可以初步确定CHO细胞在无血清培养基中能够正常生长，同时具有悬浮生长的能力。目前，抗体蛋白的表达多采用哺乳动物细胞表达系统，但是哺乳动物细胞的生长较为严格，必须要在含有血清的培养基中生长，因此增加了生产的成本和污染的风险。为此本专利技术的方法可以克服CHO细胞在表达抗体时出现的上述难题，为抗体的大规模生产提供了理想的实验基础。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种表达狂犬抗体的CHO细胞无血清悬浮培养方法。本专利技术要解决的另外一个技术问题是提供一种优化的CHO细胞无血清培养基。对于CHO细胞无血清悬浮培养方法，本专利技术采用的技术方案是，表达狂犬抗体的CHO细胞无血清悬浮培养方法，包括以下步骤：(1)细胞株的培养：所述细胞株为中国仓鼠卵巢细胞，且以下简称为细胞；将细胞以2×105～6×105cells/ml的数量接种于血清培养基，培养条件为37℃，5.0％二氧化碳的培养箱，得到细胞A；测定细胞A的生长曲线以及加入微量的促生长因子后细胞A的生长曲线；所述促生长因子为促生长剂G-CSF-RCHP，且按0.2～0.4μL/ml添加至血清培养基；所述血清培养基为含有10％胎牛血清的IMDM液体溶液；(2)细胞的收集：将生长于血清培养基中的细胞A，使用胰酶处理1～5min后，收集细胞A于15ml的离心管中，1000rpm离心3min，吸入37℃预热的10ml无血清培养基溶液洗涤细胞一次，最终定容于体积5ml的无血清培养基中，得到细胞B，并采用TrypanBlue染色计数细胞B，测定细胞B的数量；所述无血清培养基由以下组分配制而成：DMEM/F12液体溶液1ml，且过滤除菌，调节pH至7.0～7.2；微量硒元素2～10ng/ml；胰岛素1-3μg/ml；转铁蛋白2～15μg/ml；促生长剂G-CSF-RCHP：0.2～0.4μl/ml；抗细胞凝团剂：0.1～0.5μl/ml；且所述无血清培养基配制完成后，使用前37℃预热备用；(3)6孔板的预处理：取pH值为7.0～7.2的1×BS溶液，稀释浓度为1mg/ml的纤维链接蛋白，得到最终工作浓度为20～80μg/ml的混合溶液，再吸取1ml混合溶液加入6孔板，处理时间为15～60min，即得到预处理6孔板；(4)细胞培养：将细胞B按2×105～6×105cells/ml的数量接种预处理6孔板中，再将细胞B依次在含有5％胎牛血清的IMDM液体培养基、含有2.5％胎牛血清的IMDM液体培养基、含有1.25％胎牛血清的IMDM液体培养基、含有0.1％胎牛血清的IMDM液体培养基中逐代培养，当细胞B充满贴壁生长或经隔夜培养生长后，即可替换为上述胎牛血清比例逐步减少的IMDM液体培养基，直至替换为无血清培养基；同时通过显微镜观察经过隔夜培养的细胞B的形态，并根据细胞B生长的状态情况，当细胞B由贴壁生长逐渐转换为悬浮生长，且细胞形态由弧形或梭形转换为圆形，将悬浮的细胞B转接未经预处理的6孔板继续培养，最终从生长的细胞B中筛选悬浮细胞，并对筛选出的悬浮细胞抗体表达进行检测。作为优选，在步骤(1)中，细胞以2×105cells/ml的数量接种于血清培养基。作为优选，步骤(4)中，细胞B按2×105cells/ml的数量接种预处理6孔板。作为优选，步骤(4)中细胞B的培养时间为3～5天。作为优选，在步骤(4)中，采用Western-Blotting的检测方式对细胞B表达抗体进行检测。对于CHO细胞无血清培养基，本专利技术采用的技术方案是，一种优化的CHO细胞无血清培养基，由以下组分组成：DMEM/F12液体溶液：1ml，过滤除菌，pH至7.0～7.2；微量硒元素：2～10ng/ml；胰岛素：1～3μg/ml；转铁蛋白：2～15μg/ml；促生长剂量G-CSF-RCHP：0.2～0.4μl/ml；抗细胞凝团剂：0.1～0.5μl/ml。本专利技术的有益效果是：1、选用常用的哺乳动物细胞表达系统CHO细胞进行研究，通过改进实验的方法，确定无血清悬浮化培养的条件；2、无血清培养细胞，可以极大地降低生产成本，降低外源蛋白的污染；3、提高抗体蛋白的表达量，且在无血清中培养容易纯化目的蛋白，提高生产效率。具体实施方式实施例1：无血清培养基无血清培养基采用DMEM/F12，不含有胎牛血清，并且加入微量元素和转铁蛋白，加入微量的生长促生剂，无血清培养基成分详见表1。无血清培养基配制完成后，使用前37℃预热备用。表1实施例2：CHO细胞(以下简称为细胞)的培养细胞株为CHO贴壁细胞株AC4。初始培养基采用含有10％胎牛血清的IMDM细胞培养基(以下简称为血清培养基)，将细胞以2×105cells/ml的数量接种于6孔细胞培养板中，培养条件为37℃，含有5.0％二氧化碳的培养箱，培养细胞数量达到2～6×106cells/ml时，备用。实施例3：处理培养的CHO细胞将生长于血清培养基中的细胞，使用胰酶处理1～5min后，收集细胞于15ml的离心管中，1000rpm离心3min，吸入预热的无血清培养基10ml洗涤细胞一次，最终定容至5ml的无血清培养基中，细胞B，采用TrypanBlue染色细胞B，测定细胞B的数本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.表达狂犬抗体的CHO细胞无血清悬浮培养方法，包括以下步骤：(1)细胞株的培养：所述细胞株为中国仓鼠卵巢细胞，且以下简称为细胞；将细胞以2×105～6×105cells/ml的数量接种于血清培养基，培养条件为37℃，5.0％二氧化碳的培养箱，得到细胞A；测定细胞A的生长曲线以及加入微量的促生长因子后细胞A的生长曲线；所述促生长因子为促生长剂G‑CSF‑RCHP，且按0.2～0.4μL/ml添加至血清培养基；所述血清培养基为含有10％胎牛血清的IMDM液体溶液；(2)细胞的收集：将生长于血清培养基中的细胞A，使用胰酶处理1～5min后，收集细胞A于15ml的离心管中，1000rpm离心3min，吸入37℃预热的10ml无血清培养基溶液洗涤细胞一次，最终定容于体积5ml的无血清培养基中，得到细胞B，并采用Trypan Blue染色计数细胞B，测定细胞B的数量；所述无血清培养基由以下组分配制而成：DMEM/F12液体溶液1ml，且过滤除菌，调节pH至7.0～7.2；微量硒元素2～10ng/ml；胰岛素1‑3μg/ml；转铁蛋白2～15μg/ml；促生长剂G‑CSF‑RCHP：0.2～0.4μl/ml；抗细胞凝团剂：0.1～0.5μl/ml；且所述无血清培养基配制完成后，使用前37℃预热备用；(3)6孔板的预处理：取pH值为7.0～7.2的1×BS溶液，稀释浓度为1mg/ml的纤维链接蛋白，得到最终工作浓度为20～80μg/ml的混合溶液，再吸取1ml混合溶液加入6孔板，处理时间为15～60min，即得到预处理6孔板；(4)细胞培养：将细胞B按2×105～6×105cells/ml的数量接种预处理6孔板中，再将细胞B依次在含有5％胎牛血清的IMDM液体培养基、含有2.5％胎牛血清的IMDM液体培养基、含有1.25％胎牛血清的IMDM液体培养基、含有0.1％胎牛血清的IMDM液体培养基中逐代培养，当细胞B充满贴壁生长或经隔夜培养生长后，即可替换为上述胎牛血清比例逐步减少的IMDM液体培养基，直至替换为无血清培养基；同时通过显微镜观察经过隔夜培养的细胞B的形态，并根据细胞B生长的状态情况，当细胞B由贴壁生长逐渐转换为悬浮生长，且细胞形态由弧形或梭形转换为圆形，将悬浮的细胞B转接未经预处理的6孔板继续培养，最终从生长的细胞B中筛选悬浮细胞，并对筛选出的悬浮细胞抗体表达进行检测。...

【技术特征摘要】
1.表达狂犬抗体的CHO细胞无血清悬浮培养方法，包括以下步骤：(1)细胞株的培养：所述细胞株为中国仓鼠卵巢细胞，且以下简称为细胞；将细胞以2×105～6×105cells/ml的数量接种于血清培养基，培养条件为37℃，5.0％二氧化碳的培养箱，得到细胞A；测定细胞A的生长曲线以及加入微量的促生长因子后细胞A的生长曲线；所述促生长因子为促生长剂G-CSF-RCHP，且按0.2～0.4μL/ml添加至血清培养基；所述血清培养基为含有10％胎牛血清的IMDM液体溶液；(2)细胞的收集：将生长于血清培养基中的细胞A，使用胰酶处理1～5min后，收集细胞A于15ml的离心管中，1000rpm离心3min，吸入37℃预热的10ml无血清培养基溶液洗涤细胞一次，最终定容于体积5ml的无血清培养基中，得到细胞B，并采用TrypanBlue染色计数细胞B，测定细胞B的数量；所述无血清培养基由以下组分配制而成：DMEM/F12液体溶液1ml，且过滤除菌，调节pH至7.0～7.2；微量硒元素2～10ng/ml；胰岛素1-3μg/ml；转铁蛋白2～15μg/ml；促生长剂G-CSF-RCHP：0.2～0.4μl/ml；抗细胞凝团剂：0.1～0.5μl/ml；且所述无血清培养基配制完成后，使用前37℃预热备用；(3)6孔板的预处理：取pH值为7.0～7.2的1×BS溶液，稀释浓度为1mg/ml的纤维链接蛋白，得到最终工作浓度为20～80μg/ml的混合溶液，再吸取1ml混合溶液加入6孔板，处理时间为15～60min，即得到预处理6孔板；(4)细胞培养：将细胞B按2×105～6×105cells/ml的数量接种预处理6孔板中，再将...

【专利技术属性】
技术研发人员：张建，谢雍，王仲家，
申请(专利权)人：安徽省农业科学院园艺研究所，
类型：发明
国别省市：安徽,34