人羊膜上皮干细胞向黑色素细胞诱导分化培养基及其方法技术

本发明专利技术涉及人羊膜上皮干细胞向黑色素细胞诱导分化培养基及其方法。在α‑MEM基础培养基中添加内皮素3,地塞米松，干细胞因子，碱性成纤维细胞生长因子，胰岛素铁硒传递蛋白和胎牛血清。方法是将人羊膜制成人羊膜上皮干细胞悬液；将细胞置于添加内皮素3,地塞米松，干细胞因子，碱性成纤维细胞生长因子，胰岛素铁硒传递蛋白和胎牛血清的α‑MEM培养基中；在37℃，5% CO2培养箱中培养成羊膜上皮干细胞贴壁单层，逐渐诱导分化成表达黑色素细胞标记基因酪氨酸酶相关蛋白l（trp1），2（trp2）、小眼畸形相关转录因子（mitf）、酪氨酸酶（dtc）阳性的黑色素细胞。具有细胞来源丰富、免疫原性低，不受伦理限制，诱导方法简便的特点。

Culture medium for inducing differentiation of human amniotic epithelial stem cells into melanocytes and its methods

The invention relates to a culture medium for inducing differentiation of human amniotic epithelial stem cells into melanocytes and a method thereof. Endothelin 3, dexamethasone, stem cell factor, basic fibroblast growth factor, insulin ferric selenium transferrin and fetal bovine serum were added to the basal medium of alpha MEM. The human amniotic membrane was used to make adult amniotic epithelial stem cell suspension, and the cells were placed in the medium of endothelin 3, dexamethasone, stem cell factor, basic fibroblast growth factor, insulin ferric selenium transferrin and fetal bovine serum MEM medium, and cultured into amniotic epithelial stem cells at 37, 5% CO2 culture box. The layer is gradually induced to differentiate into tyrosinase related protein L (TRP1), 2 (Trp2), small eye malformation related transcription factor (MITF) and tyrosinase (DTC) positive melanocytes. It has the characteristics of abundant cell source, low immunogenicity, no ethical restriction and simple induction method.

【技术实现步骤摘要】
人羊膜上皮干细胞向黑色素细胞诱导分化培养基及其方法
本专利技术属于生物
的一种上皮干细胞分化为黑色素细胞培养基及其方法，具体涉及的是人羊膜上皮干细胞向黑色素细胞诱导分化培养基及其方法。
技术介绍
皮肤色素沉着对人类的健康和皮肤美观起着至关重要的作用，尤其是面部等暴露部位皮肤更为重要。由于黑色素细胞合成的色素可以保护机体免受环境的攻击和各种危险细胞的侵袭，所以皮肤色素的缺失不仅可以导致白癜风等免疫性疾病，而且影响患者的心理健康。白癜风是一种常见的后天性限局性或泛发性皮肤色素脱失病。由于皮肤的黑色素细胞功能消失引起，全身各部位均可发生，常见于指背、腕、前臂、颜面、颈项及生殖器周围等。但机制还不清楚。除药物治疗、脱色疗法、物理疗法、对皮损稳定无进展的患者可行自体表皮移植手术外，还有一项专利技术专利将自体脂肪间充质干细胞定向分化为黑色素细胞的方法(专利号CN201710169785.9)等自体黑色素细胞移植治疗方法。不仅脂肪间充质干细胞来源于中胚层，且由于取患者自体正常皮肤进行诱导黑色素细胞时，取材形成创面局部宜形成新的白癜风。人羊膜上皮干细胞和黑色素细胞均来源于外胚层神经嵴，更易分化为黑色素细胞。因此，异体黑色素细胞移植治疗已成为最优选的治疗方案之一。干细胞是未分化细胞且具有多向分化潜能，可以分化形成各种特定类型的目标细胞。在众多的干细胞中，人羊膜上皮干细胞不仅与黑色素细胞均来源于外胚层神经嵴，而且具有免疫源性低、取材方便等优点，必将成为异体黑色素细胞移植治疗白癜风的优先选择目标细胞。
技术实现思路
本专利技术针对现有白癜风治疗方法的自体黑色素细胞来源困难及异体黑色素细胞来源免疫源性限制等问题，而提供同种异体来源广泛，无或低免疫源性问题的一种人羊膜上皮干细胞向黑色素细胞诱导分化培养基及其方法。本专利技术技术方案如下：人羊膜上皮干细胞向黑色素细胞诱导分化培养基，包括：人羊膜上皮干细胞向黑色素细胞诱导分化方法，包括如下步骤：(1)人羊膜上皮干细胞分离及单细胞悬液的制备采用机械法剥离羊膜组织，用生理盐水反复冲洗，除尽表面血迹，取人羊膜5×5cm2，剪碎，置于15×15cm2平皿中，加入0.25克/升胰蛋白酶，37℃消化20-35分钟后，用10-20％胎牛血清中止消化，收集上清液，再用同样方法消化7-12分钟后中止消化，将上述2次收集上清液混合，过200目细胞筛后，将滤液在800-1200转/分钟条件下，离心8-12分钟，弃上清，得到细胞悬液；将细胞悬液过滤，制成单细胞悬液；(2)人羊膜上皮干细胞的培养及扩增将第(1)步所得到细胞接种于含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基中，置于37℃，饱和湿度，体积分数为5％的CO2培养箱中进行培养，并通过换液及扩增，获得第2-3代人羊膜上皮干细胞；在上述第(2)步中，将第(1)步所得到细胞以2×106L-1-2×107L-1密度接种于培养基中培养；(3)人羊膜上皮干细胞的诱导分化取第2-3代人羊膜上皮干细胞接种于含10-20％胎牛血清的DMEM/12培养基的12孔板中培养，至细胞80％以上融合后，更换黑色素细胞诱导分化培养基，置于37℃，饱和湿度，体积分数为5％CO2培养箱中培养，每2-3天换液1次，连续培养80-120天；所述黑色素细胞诱导分化培养基采用α-MEM液体培养基500ml，其中含内皮素3100nM,地塞米松50nM，干细胞因子50nM，碱性成纤维细胞生长因子4nM，胰岛素铁硒传递蛋白1×和10％胎牛血清；在上述第(3)步中，将第(2)步所得到细胞以2×106L-1-2×107L-1密度接种于培养基中培养。本专利技术人羊膜上皮干细胞向黑色素细胞诱导分化方法，还包括人羊膜上皮干细胞与黑色素细胞均来源于外胚层。本专利技术的优点在于人羊膜上皮细胞与人黑色素细胞均来源于外胚层，诱导分化方法简便易行，而且人羊膜上皮干细胞来源于人羊膜。人羊膜为胎儿出生后的废弃物，取材方便，具有来源广泛，经济效益显著；低免疫原性，不受伦理限制等优越性。诱导后获得的黑色素细胞不仅可用于异体白癜风疾病的治疗，而且治疗效果非常显著。附图说明图1为原代分离培养24小时后羊膜上皮干细胞形态观察(×40)图。图2为第2代羊膜上皮干细胞形态观察(×40)图。图3为人羊膜上皮干细胞向黑色素细胞诱导前细胞形态倒置显微镜观察(×40)图。图4为人羊膜上皮干细胞向黑色素细胞诱导60天后细胞形态倒置显微镜观察(×40)图。图5为人羊膜上皮干细胞向黑色素细胞诱导100天后胞形态倒置显微镜观察可见明显色素颗粒(×40)图。图6为Western-blot鉴定人羊膜上皮干细胞未诱导、诱导分化60天和诱导分化100天黑色素细胞标记基因trp1表达(P＜0.05)图。图7为Western-blot鉴定人羊膜上皮干细胞未诱导、诱导分化60天和诱导分化100天黑色素细胞标记基因trp2表达(P＜0.05)图。图8为Real-timePCR鉴定人羊膜上皮干细胞未诱导、诱导分化60天和诱导分化100天，黑色素细胞标记基因trp1、trp2、mitf、dtc表达(P＜0.05)图。图9为免疫荧光法鉴定人羊膜上皮干细胞诱导分化后黑色素细胞标记基因trp1免疫荧光染色表达(×100)图。图10为免疫荧光法鉴定人羊膜上皮干细胞诱导分化后黑色素细胞标记基因trp2免疫荧光染色表达(×100)图。具体实施方式下面结合附图和实施例详细描述本专利技术：实施例1本专利技术一种人羊膜上皮干细胞向黑色素细胞诱导分化培养基，包括：制成为水溶液。实施例2本专利技术一种人羊膜上皮干细胞向黑色素细胞诱导分化培养基，包括：制成为水溶液。实施例3本专利技术一种人羊膜上皮干细胞向黑色素细胞诱导分化培养基，包括：制成为水溶液。实施例4本专利技术人羊膜上皮干细胞向黑色素细胞诱导分化方法，包括如下步骤：(1)人羊膜上皮干细胞分离及单细胞悬液的制备在无菌条件下取正常足月剖腹产胎儿(男性)的人胎盘；检测甲型肝炎抗体、乙型肝炎病毒表面抗原、乙型肝炎病毒表面抗体、乙型肝炎病毒e抗原、乙型肝炎病毒e抗体、乙型肝炎核心抗体IgM、丙型肝炎抗体、戊型肝炎抗体、艾滋病病毒抗体、梅毒螺旋体抗体等其他相关传染性指标均呈阴性；在无菌超净台上钝性分离胎盘脐带面的羊膜，用生理盐水反复冲洗，除尽表面血迹，取人羊膜5×5cm2，剪碎，置于15×15cm2平皿中，加入0.25g/L胰蛋白酶，37℃消化20-35分钟后，用10-20％胎牛血清中止消化，收集上清液，再用同样方法消化7-12分钟后中止消化，将上述2次收集上清液混合，用200目细胞筛过滤后，将滤液在800-1200转/分钟条件下，离心8-12分钟，弃上清，制成单细胞悬液；(2)人羊膜上皮干细胞的培养及扩增将第(1)步所得到细胞接种于含10％FBS的DMEM/F12培养基中，置于37℃，饱和湿度，体积分数为5％的CO2培养箱中进行培养，培养48-72小时后，更换培养液，弃去未贴壁细胞，根据细胞生长情况，每2-4天全量换液一次，待细胞达到80％-90％融合时，按1:2或1:3比例进行传代，并记为P1代。再重复上述操作进行传代，此传代培养记为P2代；再次重复上述操作进行传代，此传代培养记为P3代。通过上述换液及扩增，获得第2-3代人羊膜上皮干细胞；在上述第(2)步中，将第(1)步所本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人羊膜上皮干细胞向黑色素细胞诱导分化培养基，其特征在于包括：

【技术特征摘要】
1.一种人羊膜上皮干细胞向黑色素细胞诱导分化培养基，其特征在于包括：2.一种人羊膜上皮干细胞向黑色素细胞诱导分化方法，其特征在于包括以下步骤：(1)人羊膜上皮干细胞分离及单细胞悬液的制备取人羊膜，剪碎，用0.25克/升胰蛋白酶消化2次，第1次消化20-35分钟，第2次消化7-12分钟,用10-20％胎牛血清终止消化，收取上述2次上清液混合，800-1200转/分钟，离心8-12分钟，得到细胞悬液；将细胞悬液过滤，制成单细胞悬液；(2)人羊膜上皮干细胞的培养及扩增将第(1)步所得到细胞接种于含10％胎牛血清的达尔伯克(氏)改良伊格尔(氏)/F12(DMEM/F12)培养基中，置于37℃，饱和湿度，体积分数为5％的CO2培养箱中进行培养，并通过换液及扩增，获得第2-3代人羊膜上皮干细胞；在上述第(2)步中，将第(1)步所得到细胞以2×106L-1-2×107L-...

【专利技术属性】
技术研发人员：庞希宁，王瑞，施萍，
申请(专利权)人：沈阳艾米奥生物工程技术研发中心有限公司，
类型：发明
国别省市：辽宁,21