一种检测猪脾转移因子与猪瘟活疫苗联合免疫效果的方法技术

本发明专利技术提供了一种检测猪脾转移因子与猪瘟活疫苗联合免疫效果的方法，包括以下步骤：1）细胞培养；2）细胞接种，控制细胞密度；3）将猪瘟活疫苗与猪脾转移因子上样于细胞培养板中，培养孵育细胞；4）将细胞用MTT溶液进行反应，继续孵育，然后用DMSO进行溶解处理，最后将细胞板放置与酶标仪中测量OD值，计算细胞活性。本发明专利技术方法具有检测背景低、灵敏度高、专属性强、准确度高、重复性好等优点，尤其适用于猪脾转移因子和猪瘟活疫苗联合免疫时生物活性的检测及质量标准的建立。

A method for detecting immune effect of swine spleen transfer factor combined with live swine fever vaccine

The present invention provides a method to detect the combined immune effect of pig spleen transfer factor and live swine fever vaccine, including the following steps: 1) cell culture; 2) cell inoculation, control cell density; 3) the live vaccine of swine fever and pig spleen transfer factor are like in cell culture plate, incubated cells; 4) the cells are used in MTT solution. The cells were incubated, then dissolved with DMSO, and OD values were measured with enzyme labeling apparatus. The method has the advantages of low detection background, high sensitivity, high specificity, high accuracy and good repeatability. It is especially suitable for the detection of biological activity and the establishment of the quality standard of pig spleen transfer factor and live swine fever vaccine.

【技术实现步骤摘要】
一种检测猪脾转移因子与猪瘟活疫苗联合免疫效果的方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种检测猪脾转移因子与猪瘟活疫苗联合免疫效果的方法。
技术介绍
转移因子（TransferFactor，TF）能调节动物机体免疫功能，协同疫苗免疫，缩短疫苗免疫应答期，提高动物免疫水平，具有非常广阔的应用前景。转移因子是存在于人和动物白细胞中的可透析小分子物质，能将供体所具有的细胞免疫功能转移给受体，从而非特异性地增强受体的免疫功能。转移因子的成分主要包括低聚核苷酸和多肽，能诱导机体免疫细胞活化，增强机体免疫力，能转移包括病毒、细菌、寄生虫、真菌、组织相容性抗原和肿瘤抗原等多种抗原的细胞免疫。此外，转移因子具有分子质量小、无毒、无抗原性、不引起过敏反应、不产生对抗抗体且可超越种系界限应用等优点。由于转移因子使用安全、作用迅速、效果显著、无药物残留、无抗原性、无毒副作用，且来源广，同时，其作为免疫激发剂和辅助制剂，可显著提高对动物疾病的防控效果，市场认可度逐渐提高。因此，转移因子在兽医临床领域，将逐步地释放其应用优势，转移因子产品的开发与应用将对畜牧业的发展具有十分重要的现实意义。猪瘟俗称"烂肠瘟"是一种具有高度传染性疫病，是威胁养猪业的主要传染病之一，其特征是：急性，呈败血性变化，实质器官出血，坏死和梗死；慢性呈纤维素性坏死性肠炎，后期常有副伤寒及巴氏杆菌病继发。该病主要通过直接接触，或由于接触污染的媒介物而发病。消化道、鼻腔粘膜和破裂的皮肤均是感染途径。一年四季都可发生，以春夏多雨季节为多。大量的试验研究表明，转移因子对猪瘟活疫苗具有协同作用，能显著提高机体细胞免疫水平，缩短机体免疫应答期，促进抗体的产生，并延长抗体高峰期，使之维持更长的时间。但目前检测转移因子与猪瘟活疫苗联合使用效果的主要通过检测抗体及细胞因子来展现，检测成本高、周期长且生物体个体差异大，检测结果较不稳定。因此建立一种快速、方便、检验成本低且检验结果相对稳定的检测猪脾转移因子与猪瘟活疫苗联合免疫效果的方法具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种在细胞上展现的、检验成本低且检验结果相对稳定的检测猪脾转移因子与猪瘟活疫苗联合免疫效果的方法为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：一种检测猪脾转移因子与猪瘟活疫苗联合免疫效果的方法，其包括以下步骤：1）取猪瘟活疫苗原液，用含1.8-2.2%新生牛血清、0.8-1.2%青霉素-链霉素双抗的完全DMEM培养基稀释至含100RID的病毒液；取猪脾转移因子，用含1.8-2.2%新生牛血清、0.8-1.2%青霉素-链霉素双抗的完全DMEM培养基稀释将多肽含量稀释至1mg/mL；2）在含8-12%新生牛血清、0.8-1.2%青霉素-链霉素双抗的完全DMEM培养基中将细胞培养至单层；3)取步骤2)中的单层细胞，用含8-12%新生牛血清、0.8-1.2%青霉素-链霉素双抗的完全DMEM培养基稀释，调整细胞浓度为2~3×105个/mL，将稀释后的细胞接种于细胞培养板中，继续培养；形成细胞单层后用磷酸盐缓冲液洗涤细胞板，去除培养基；4）将步骤1）稀释后的病毒液以及稀释后的猪脾转移因子上样于步骤3）的细胞培养板中，并培养孵育细胞；上样量为100μL/孔，具体如下：含1.8-2.2%新生牛血清、0.8-1.2%青霉素-链霉素双抗的完全DMEM培养基25-35μL；病毒液30-40μL；猪脾转移因子30-40μL；5)将步骤4）孵育的细胞用MTT溶液进行反应，继续孵育；6)将步骤5）孵育的细胞用二甲基亚砜进行溶解处理；7）将步骤6）处理后的细胞板放置于酶标仪中测量OD值，测定细胞活性。步骤1）中，所述猪瘟活疫苗为猪瘟活疫苗（兔源）。步骤2）中，所述细胞为pk-15细胞。步骤3）中，所述细胞培养板为96孔细胞培养板。进一步，步骤3）中，细胞稀释的具体步骤如下：将步骤2)中的单层细胞用无钙、镁离子的磷酸盐缓冲液洗2-3次，然后加入1.0mL胰酶消化液，轻轻摇动培养皿，使消化液布满所有细胞表面，于37℃放置数分钟，然后弃去消化液，用含8-12%新生牛血清、0.8-1.2%青霉素-链霉素双抗的完全DMEM培养基将细胞洗脱，将洗脱后的细胞悬液进行稀释，调整细胞浓度为2~3×105个/mL。进一步，步骤3）中，稀释后的细胞培养条件为：细胞接种量100μL/孔，在36.5-37.5℃、4.5-5.5%CO2条件下培养18-24h形成细胞单层。优选的，步骤4）中，上样量具体如下：含1.8-2.2%新生牛血清、0.8-1.2%青霉素-链霉素双抗的完全DMEM培养基30μL；病毒液35μL；猪脾转移因子35μL（即猪脾转移因子的浓度为350μg/mL）。步骤4）中，培养孵育细胞的条件为在36.5-37.5℃、4.5-5.5%CO2条件下培养40-48h。步骤5）中，细胞继续孵育的时间为3.5-4.5h。步骤7）中，于480-500nm波长处测量OD值。本专利技术采用以上方法对猪脾转移因子和猪瘟活疫苗联合免疫效果进行检测，和现有技术不同点在于，现有技术检测均在实体动物上（猪）检测，检验成本高，周期长且生物个体差异大易导致结果不稳定，而本专利技术方法是在细胞上展现，快速、方便，检验成本低，结果相对稳定。附图说明图1为不同TF浓度对pk-15细胞体外增殖的测定结果；上标“*”表示差异显著(P<0.05)；上标“**”表示差异极显著(P<0.01)；图2为不同体积疫苗稀释液对pk-15细胞体外增殖的测定结果；图3为8批TF溶液与猪瘟活疫苗联合使用时，细胞增殖的测定结果；上标“*”表示差异显著(P<0.05)；上标“**”表示差异极显著(P<0.01)。具体实施方式一种检测猪脾转移因子与猪瘟活疫苗联合免疫效果的方法，包括以下步骤：1）取猪瘟活疫苗（兔源）原液，用含1.8-2.2%新生牛血清、0.8-1.2%青霉素-链霉素双抗的完全DMEM培养基稀释至含100RID的病毒液；取猪脾转移因子，用含1.8-2.2%新生牛血清、0.8-1.2%青霉素-链霉素双抗的完全DMEM培养基稀释将多肽含量稀释至1mg/mL；2）在含8-12%新生牛血清、0.8-1.2%青霉素-链霉素双抗的完全DMEM培养基中将pk-15细胞培养至单层；3)将步骤2）中的单层细胞用无钙、镁离子的磷酸盐缓冲液洗2-3次，然后加入1.0mL胰酶消化液，轻轻摇动培养皿，使消化液布满所有细胞表面，于37℃放置数分钟，然后弃去消化液，用含8-12%新生牛血清、0.8-1.2%青霉素-链霉素双抗的完全DMEM培养基将细胞洗脱，将洗脱后的细胞悬液进行稀释，调整细胞浓度为2~3×105个/mL，将稀释后的细胞接种于96孔细胞培养板中，100μL/孔，在36.5-37.5℃、4.5-5.5%CO2条件下培养20h左右（18-24h）形成细胞单层，然后用磷酸盐缓冲液洗涤细胞板，去除培养基；4）将步骤1）稀释后的病毒液以及稀释后的猪脾转移因子上样于步骤3）的细胞培养板中，在36.5-37.5℃、4.5-5.5%CO2条件下培养40-48h；其中，上样量为100μL/孔，具体如下：含1.8-2.2%新生牛血清、0.8-1.2%青霉素-链霉素双抗的完全本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测猪脾转移因子与猪瘟活疫苗联合免疫效果的方法，其特征在于：其包括以下步骤：1）取猪瘟活疫苗原液，用含1.8‑2.2%新生牛血清、0.8‑1.2%青霉素‑链霉素双抗的完全DMEM培养基稀释至含100 RID的病毒液；取猪脾转移因子，用含1.8‑2.2%新生牛血清、0.8‑1.2%青霉素‑链霉素双抗的完全DMEM培养基稀释将多肽含量稀释至1 mg/mL；2）在含8‑12%新生牛血清、0.8‑1.2%青霉素‑链霉素双抗的完全DMEM培养基中将细胞培养至单层；3) 取步骤2)中的单层细胞，用含8‑12%新生牛血清、0.8‑1.2%青霉素‑链霉素双抗的完全DMEM培养基稀释，调整细胞浓度为2~3×105个/mL，将稀释后的细胞接种于细胞培养板中，继续培养；形成细胞单层后用磷酸盐缓冲液洗涤细胞板，去除培养基；4）将步骤1）稀释后的病毒液以及稀释后的猪脾转移因子上样于步骤3）的细胞培养板中，并培养孵育细胞；上样量为100 μL/孔，具体如下：含1.8‑2.2%新生牛血清、0.8‑1.2%青霉素‑链霉素双抗的完全DMEM培养基25‑35μL ；病毒液30‑40μL；猪脾转移因子30‑40 μL；5) 将步骤4）孵育的细胞用MTT溶液进行反应，继续孵育；6) 将步骤5）孵育的细胞用二甲基亚砜进行溶解处理；7）将步骤6）处理后的细胞板放置于酶标仪中测量OD值，测定细胞活性。...

【技术特征摘要】
1.一种检测猪脾转移因子与猪瘟活疫苗联合免疫效果的方法，其特征在于：其包括以下步骤：1）取猪瘟活疫苗原液，用含1.8-2.2%新生牛血清、0.8-1.2%青霉素-链霉素双抗的完全DMEM培养基稀释至含100RID的病毒液；取猪脾转移因子，用含1.8-2.2%新生牛血清、0.8-1.2%青霉素-链霉素双抗的完全DMEM培养基稀释将多肽含量稀释至1mg/mL；2）在含8-12%新生牛血清、0.8-1.2%青霉素-链霉素双抗的完全DMEM培养基中将细胞培养至单层；3)取步骤2)中的单层细胞，用含8-12%新生牛血清、0.8-1.2%青霉素-链霉素双抗的完全DMEM培养基稀释，调整细胞浓度为2~3×105个/mL，将稀释后的细胞接种于细胞培养板中，继续培养；形成细胞单层后用磷酸盐缓冲液洗涤细胞板，去除培养基；4）将步骤1）稀释后的病毒液以及稀释后的猪脾转移因子上样于步骤3）的细胞培养板中，并培养孵育细胞；上样量为100μL/孔，具体如下：含1.8-2.2%新生牛血清、0.8-1.2%青霉素-链霉素双抗的完全DMEM培养基25-35μL；病毒液30-40μL；猪脾转移因子30-40μL；5)将步骤4）孵育的细胞用MTT溶液进行反应，继续孵育；6)将步骤5）孵育的细胞用二甲基亚砜进行溶解处理；7）将步骤6）处理后的细胞板放置于酶标仪中测量OD值，测定细胞活性。2.根据权利要求1所述的一种检测猪脾转移因子与猪瘟活疫苗联合免疫效果的方法，其特征在于：步骤1）中，所述猪瘟活疫苗为兔源猪瘟活疫苗。3.根据权利要求1所述的一种检测猪脾转移因子与猪瘟活疫苗联合免疫效果的方法，其特征在于：步骤2）中，所述细胞为pk-15细胞。4.根据权利要求1所述的一种检测...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢兆文，谭礼宁，吕小婷，叶盛聪，邱灵珊，陈盛勇，刘楚楚，徐磊，刘友霖，
申请(专利权)人：派生特福州生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：福建,35