一种基于肾小管上皮细胞培养造影剂损伤模型的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于肾小管上皮细胞培养造影剂损伤模型的方法，包括如下步骤：(1)HK‑2细胞复苏；(2)细胞传代培养；(3)显微镜下观察培养期细胞形态，当细胞边缘皱缩变圆，折光性增强时，离心，加入完全培养基制成细胞重悬液；(4)将细胞重悬液转接入完全培养基中，接种密度为40％～50％，培养；(5)当细胞生长密度达80％～90％时，进行离心，加入完全培养基制成细胞重悬液(细胞浓度为1.0～1.5*106个/ml)；(6)将制成的细胞重悬液，按每40～60ul接种至2ml的完全培养基中，进行培养40～50h，换无血清培养基培养4～8h，然后加入浓度为45～55mgI/ml的碘克沙醇溶液，继续培养5～7h后得到损伤模型细胞。本发明专利技术能够培养出与造影剂肾病患者术后血清HMGB‑1含量类似、损伤更接近、体系毒素更少的细胞损伤模型。

A method for culturing contrast medium damage model based on renal tubular epithelial cells

The present invention discloses a method based on a renal tubular epithelial cell culture contrast agent damage model, including the following steps: (1) HK 2 cell resuscitation; (2) cell subculture; (3) observation of cell morphology under microscope, when the edge of the cell shrinks and turns round, and when the refraction is enhanced, it is centrifuged and added into the complete medium to make cells. (4) the cell suspension was transferred into the complete medium, the inoculation density was 40% ~ 50%, and (5) centrifugation was carried out when the cell growth density was 80% ~ 90%, and the cell suspension was made into the complete medium (1 to 1.5*106 /ml); (6) the cell suspension was inoculated by 40 to 60ul. In the complete medium of 2ml, 40 to 50h were cultured, and serum-free medium was cultured for 4 ~ 8h, and iodipine solution with a concentration of 45 to 55mgI/ml was added, and the damaged model cells were obtained after 5 to 7h. The invention can cultivate a cell injury model similar to that of patients with contrast nephropathy after operation, with a similar content of HMGB 1, with a closer injury and less systemic toxin.

【技术实现步骤摘要】
一种基于肾小管上皮细胞培养造影剂损伤模型的方法
本专利技术涉及造影剂细胞损伤模型制备
，具体涉及一种基于肾小管上皮细胞培养造影剂损伤模型的方法。
技术介绍
由于血管造影及介入诊疗技术在疾病诊断上具有不可替代的优势，碘造影剂的使用越来越广泛。然而，造影剂肾病的发生数量不断上升。至目前为止，造影剂肾病已成为医源性肾衰竭的第三大病因，发病率仅次于肾灌注不足和肾毒性药物。造影剂肾病的发生机制未完全明确，其中血清高迁移率族蛋白-1(HMGB-1)是近年发现的一种高度保守的核蛋白，主要作用是稳定染色体结构并协助其功能，参与DNA复制、转录、重组和修复；HMGB-1作为一个经典的损伤相关模式分子，不仅有促进炎症反应、细胞分化等作用，而且还对线粒体自噬有重要的调控作用。碘造影剂引起体内升高，介导PINK1-Parkin信号通路致使肾小管上皮细胞线粒体自噬异常，是造影剂肾病发生的其中原因之一。由于伦理问题，不能直接在人体开展深入研究，分子机制往往需通过体外细胞实验证实，但至今虽然有通过在体外细胞培养液中加入造影剂而获得人肾小管上皮细胞损伤的报道，但得到的只是受损严重的人肾小管上皮细胞，与实际造影剂肾病患者体内损伤细胞及胞外环境相差很大，不利于相关药物的研发试验，甚至导致相关药物试验结果的错误。因此，目前尚未发现有建立合适的引起HMGB-1升高而导致肾小管上皮细胞损伤的稳定研究模型。以上
技术介绍
内容的公开仅用于辅助理解本专利技术的构思及技术方案，其并不必然属于本专利申请的现有技术，在没有明确的证据表明上述内容在本专利申请的申请日已经公开的情况下，上述
技术介绍
不应当用于评价本申请的新颖性和创造性。
技术实现思路
本专利技术针对上述技术问题提供一种基于肾小管上皮细胞培养出与造影剂肾病患者术后血清HMGB-1含量类似、损伤更接近、体系毒素更少的细胞损伤模型的培养方法。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种基于肾小管上皮细胞培养造影剂损伤模型的方法，包括如下步骤：(1)HK-2细胞复苏；(2)将复苏后的HK-2细胞在完全培养基内进行传代培养；(3)显微镜下观察培养期的细胞形态，当细胞边缘皱缩变圆，折光性增强时，将培养液在900～1100rmp下离心4～6min，弃去上清液，加入完全培养基制成细胞重悬液；(4)将第(3)步骤中的细胞重悬液转接入新鲜完全培养基中，置于培养箱中培养；(5)当细胞生长密度达80％～90％时，将细胞培养液在900～1100rmp下离心4～6min，加入完全培养基制成细胞重悬液(细胞浓度为1.0～1.9*106个/ml)；(6)将步骤(5)制成的细胞重悬液，按每40～60ul接种至2ml的新鲜完全培养基中，进行培养40～50h，换无血清培养基培养4～8h，然后加入浓度为45～55mgI/ml的碘克沙醇溶液，继续培养5～7h后得到损伤模型细胞。优选的，所述完全培养基为按10％FBS、1％双抗的比例配置。优选的，所述第(4)步骤，将第(3)步骤中的细胞重悬液转接入新鲜完全培养基中时，其接种的密度为40％～50％。优选的，所述第(3)和第(5)步骤中的离心速度为1000rmp，时间为5min。优选的，所述第(5)步骤，制成的所述细胞重悬液其细胞浓度为1.875*106个/ml或1.475*106个/ml或1.125*106个/ml或1.7*106个/ml。优选的，所述第(6)步骤，将第(5)步骤制成的细胞重悬液，按每50ul接种至2ml的新鲜完全培养基中，进行培养48h，换无血清培养基培养6h。优选的，所述第(6)步骤，加入的碘克沙醇溶液浓度为50mgI/ml。优选的，所述第(6)步骤，加入碘克沙醇溶液后，继续培养6h后得到损伤模型细胞。优选的，所述第(1)～(6)步骤中涉及到的细胞培养，培养条件为37℃、5％CO2浓度培养箱中培养。本专利技术与现有技术相比的有益效果：本专利技术通过将HK-2细胞进行传代培养后，通过离心、接种比例控制、培养时间控制等，尤其是通过结合上述步骤后，当细胞生长密度达80％～90％时，制成细胞浓度为1.0～1.5*106个/ml的细胞重悬液，按每50ul接种至2ml的新鲜完全培养基中，进行培养48小时后，再换无血清培养基培养6小时，然后加入浓度为45～55mgI/ml的碘克沙醇溶液，继续培养5～7h后得到损伤模型细胞。能够实现整个培养体系的毒素最低，细胞生长状况最佳，同时，通过对各阶段进行HMGB-1蛋白检测，发现此时体系内细胞上清液的HMGB-1蛋白含量与患者术后血清HMGB-1含量十分接近，细胞损伤更接近，进而得到理想的细胞损伤模型。具体实施方式具体实施例1一种基于肾小管上皮细胞培养造影剂损伤模型的方法，包括如下步骤：(1)HK-2细胞复苏；(2)将复苏后的HK-2细胞在按10％FBS、1％双抗的比例配置的完全培养基内置于37℃、5％CO2浓度培养箱中进行传代培养；(3)显微镜下观察培养期的细胞形态，当细胞边缘皱缩变圆，折光性增强时，将培养液在900rmp下离心6min，弃去上清液，加入完全培养基制成细胞重悬液；(4)将第(3)步骤中的细胞重悬液转接入新鲜所述完全培养基中，接种密度为40％，置于37℃、5％CO2浓度培养箱中培养；(5)当细胞生长密度达90％时，将细胞培养液在900rmp下离心6min，加入完全培养基制成细胞重悬液(细胞浓度为1.875*106个/ml)；(6)将制成的细胞重悬液，按每50ul接种至2ml的新鲜所述完全培养基中，置于37℃、5％CO2浓度培养箱中培养48小时后，换无血清培养基培养6小时，然后向培养体系加入浓度为45mgI/ml的碘克沙醇溶液，继续置于37℃、5％CO2浓度培养箱中培养7h后得到损伤模型细胞。具体实施例2一种基于肾小管上皮细胞培养造影剂损伤模型的方法，包括如下步骤：(1)HK-2细胞复苏；(2)将复苏后的HK-2细胞在按10％FBS、1％双抗的比例配置的完全培养基内置于37℃、5％CO2浓度培养箱中进行传代培养；(3)显微镜下观察培养期的细胞形态，当细胞边缘皱缩变圆，折光性增强时，将培养液在1000rmp下离心5min，弃去上清液，加入完全培养基制成细胞重悬液；(4)将第(3)步骤中的细胞重悬液转接入新鲜所述完全培养基中，接种密度为50％，置于37℃、5％CO2浓度培养箱中培养；(5)当细胞生长密度达90％时，将细胞培养液在1000rmp下离心5min，加入完全培养基制成细胞重悬液(细胞浓度1.475*106个/ml)；(6)将制成的细胞重悬液，按每50ul接种至2ml的新鲜所述完全培养基中，置于37℃、5％CO2浓度培养箱中培养48小时，换无血清培养基培养6小时，然后向培养体系加入浓度为50mgI/ml的碘克沙醇溶液，继续置于37℃、5％CO2浓度培养箱中培养6h后得到损伤模型细胞。具体实施例3一种基于肾小管上皮细胞培养造影剂损伤模型的方法，包括如下步骤：(1)HK-2细胞复苏；(2)将复苏后的HK-2细胞在按10％FBS、1％双抗的比例配置的完全培养基内置于37℃、5％CO2浓度培养箱中进行传代培养；(3)显微镜下观察培养期的细胞形态，当细胞边缘皱缩变圆，折光性增强时，将培养液在950rmp下离心5.5min，弃去上清液，加入完全培本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于肾小管上皮细胞培养造影剂损伤模型的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)HK‑2细胞复苏；(2)将复苏后的HK‑2细胞在完全培养基内进行传代培养；(3)显微镜下观察培养期的细胞形态，当细胞边缘皱缩变圆，折光性增强时，将培养液在900～1100rmp下离心4～6min，弃去上清液，加入完全培养基制成细胞重悬液；(4)将第(3)步骤中的细胞重悬液转接入新鲜完全培养基中，置于培养箱中培养；(5)当细胞生长密度达80％～90％时，将细胞培养液在900～1100rmp下离心4～6min，加入完全培养基制成细胞重悬液(细胞浓度为1.0～1.9*106个/ml)；(6)将步骤(5)制成的细胞重悬液，按每40～60ul接种至2ml的新鲜完全培养基中，进行培养40～50h，换无血清培养基培养4～8h，然后加入浓度为45～55mgI/ml的碘克沙醇溶液，继续培养5～7h后得到损伤模型细胞。

【技术特征摘要】
1.一种基于肾小管上皮细胞培养造影剂损伤模型的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)HK-2细胞复苏；(2)将复苏后的HK-2细胞在完全培养基内进行传代培养；(3)显微镜下观察培养期的细胞形态，当细胞边缘皱缩变圆，折光性增强时，将培养液在900～1100rmp下离心4～6min，弃去上清液，加入完全培养基制成细胞重悬液；(4)将第(3)步骤中的细胞重悬液转接入新鲜完全培养基中，置于培养箱中培养；(5)当细胞生长密度达80％～90％时，将细胞培养液在900～1100rmp下离心4～6min，加入完全培养基制成细胞重悬液(细胞浓度为1.0～1.9*106个/ml)；(6)将步骤(5)制成的细胞重悬液，按每40～60ul接种至2ml的新鲜完全培养基中，进行培养40～50h，换无血清培养基培养4～8h，然后加入浓度为45～55mgI/ml的碘克沙醇溶液，继续培养5～7h后得到损伤模型细胞。2.根据权利要求1所述的一种基于肾小管上皮细胞培养造影剂损伤模型的方法，其特征在于，所述完全培养基为按10％FBS、1％双抗的比例配置。3.根据权利要求1所述的一种基于肾小管上皮细胞培养造影剂损伤模型的方法，其特征在于，所述第(4)步骤，将第(3)步骤中的细胞重悬液转接入新鲜完全培养基中时，其接种的密度为4...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄锋，桂滢，陈务贤，吴菁，罗祖纯，
申请(专利权)人：广西医科大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：广西,45