广谱低致瘤性MDCK细胞系及其应用制造技术

本发明专利技术涉及广谱低致瘤性MDCK细胞系及其应用，所述的细胞株为MDCK‑15D3和MDCK‑6A8，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号分别为CCTCC NO:C2017155和CCTCC NO:C2017154，地址，湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，邮编430072，电话027‑68752319。本发明专利技术还涉及所述的细胞株的培养方法，以及所述的MDCK‑15D3、MDCK‑6A8细胞株在制备预防或治疗流感的产品中的应用。

Broad spectrum low tumorigenic MDCK cell line and its application

The present invention relates to the broad spectrum low tumorigenic MDCK cell line and its application. The cell line is MDCK 15D3 and MDCK 6A8, preserved in the Chinese typical culture storage center, and the preservation number is CCTCC NO:C2017155 and CCTCC NO:C2017154, respectively, at Wuhan University, No. 299, No. 299, Wuchang District, Wuhan City, Hubei, and 4300 72, telephone 027, 68752319. The invention also relates to the culture method of the cell line, and the application of the MDCK 15D3 and MDCK 6A8 cell line in the preparation of a product for preventing or treating influenza.

【技术实现步骤摘要】
广谱低致瘤性MDCK细胞系及其应用
本专利技术属于医药生物领域，具体而言，涉及广谱低致瘤性MDCK细胞系及其应用。
技术介绍
事实证明，不管是季节性流感，还是大流行流感肆虐人类的时候，接种流感病毒疫苗相对于使用抗流感的化学药物是更经济有效的防控手段，因此，流感病毒疫苗的研制有着非常重大和现实的意义。目前大部分流感疫苗的生产是基于鸡胚来进行的，该套生产方法已经有60多年的历史，工艺已经相当成熟，虽然部分工序可以实现自动化，但生产周期还是很长，不利于质量控制和保证，且鸡胚培养的流感病毒经过连续传代后常常会发生基因序列变异，使所制备的流感疫苗与人群中流行的流感毒株不能完全匹配。另外，在禽流感高发期，可能会因为鸡的大量感染死亡而缺乏制备疫苗的原料，此时如果仍使用鸡胚生产流感疫苗，则存在着极大的安全隐患。因此，WHO建议用哺乳动物细胞培养流感病毒来替代鸡胚制备流感疫苗，这样不仅可使其抗原性更接近自然流行株，同时还可减少宿主蛋白成分，降低鸡胚残留物引起的过敏反应。MDCK(Madin-Darbycaninekidney)细胞为连续传代细胞，是Madin和Darby在1958年从一只健康成年母狗(cockerspaniel，可卡犬，一种英国的小猎犬)的肾组织得到的，由于该细胞对流感病毒比较敏感，目前广泛应用于流感病毒的增殖和感染性滴度检测，而且经常用于流感病毒的分离培养。1997年，荷兰Solvay公司以A/Taiwan/1/86(H1N1)为毒种，基于无血清培养的MDCK细胞为基质的亚单位疫苗在I期临床中获得良好的效果，与其公司已经商品化的基于鸡胚的流感疫苗具有相同效果(Palache,AM等，JInfectDis.1997,176:20-23.)。2002年，加拿大BioChemPharma公司基于MDCK细胞的流感疫苗在健康成人、老年人和儿童的I期和II临床实验中都表现出良好的安全性和免疫原性，大约有83％～100％的受试人群在接种疫苗后血凝抑制滴度可超过40，对三价季节性流感的三种病毒的抗体反应也与传统鸡胚来源的流感疫苗相似(ScottA等，Vaccine,1998,16(13):1331-1335.和2002,20(7-8):1240-1247.)。目前，瑞士Novartis公司以MDCK细胞为基质的流感疫苗在I期和II临床实验中同样表现出良好的效果，在受试人群中表现出与基于鸡胚的流感疫苗相似的耐受性和免疫原性，完全达到了欧洲人用药品委员会(EUCommitteeforMedicinalProductsforHumanUse)会制定的关于流感疫苗的相关标准(N.Grotha等，Vaccine,2009,27(5):786-791)。虽然MDCK细胞对大部分流感病毒比较敏感，非常适合规模化生产用，制备的疫苗在人体内也能产生较好的免疫原性和抗体保护水平，但目前尚未得到WHO或我国相关部门的批准可用于人用流感疫苗的生产，其最重要和最直接的原因就是其潜在的致瘤性、致畸性、外源因子污染等安全性问题还有待解决。另外MDCK细胞表面存在的流感病毒受体的类型和数量是不同的，因此对流感病毒的增值能力也是不尽相同得，不同单克隆株之间增值能力相差可达到20倍。常规细胞培养所使用的培养基的制备方法是在基础培养基中添加相应量的血清或组织提取物，其中最常用于细胞培养基的血清是一种成分很不明确的混合物。血清对细胞在体外培养时的主要作用是提供生长因子、激素、结合蛋白，并提供保护作用。但使用血清也有以下几个不可避免的缺点：首先，血清非常昂贵，血清的费用占到培养基费用的50％，致使生产成本大幅度提高；其次，血清中含有某些不利于细胞生长的毒性物质或抑制物质，对某些细胞的体外培养有去分化作用；第三，血清中含大量成分复杂的蛋白质对下游培养产物的分离纯化带来很大的困难；第四，血清易被支原体和朊病毒等外源因子污染，这对大规模生产极为不利；第五，就是批次与批次之间血清质量的差异，会影响细胞生长，最终会影响产品质量。因此，细胞工程中无血清培养技术的应用，在很大程度上可以避免含血清培养所带来的诸多不利因素，这也是未来疫苗生产发展的必然趋势。
技术实现思路
本专利技术首先涉及一种广谱低致瘤性MDCK细胞系，所述的细胞系为MDCK-15D3、MDCK-6A8，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:C2017155和CCTCCNO:C2017154，地址，湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，邮编430072，电话027-68752319。本专利技术还涉及所述的MDCK-15D3、MDCK-6A8细胞株在制备流感病毒疫苗中的应用，所述的流感病毒优选为H1N1、H3N2、B、H5N1，所述的疫苗包括减毒活疫苗或灭活疫苗，优选为灭活疫苗，最优选的，所述的流感病毒细胞株为季节性流感病毒为H1N1(NIB-74XP)、H3N2(NIB-79)和B(BX-51B)，大流行流感病毒为禽流感H5N1(NIBRG-14)。本专利技术还涉及所述的MDCK-15D3、MDCK-6A8细胞株的培养方法，所述的培养基为无血清VP-SFM培养基，培养参数为37℃，5％CO2；接种密度为细胞密度1.5×104(cell/cm2)。本专利技术还涉及所述的MDCK-15D3、MDCK-6A8细胞株生产的流感疫苗在制备预防或治疗流感的产品中的应用。本专利技术还涉及所述的MDCK-15D3、MDCK-6A8细胞株在制备预防或治疗流感的产品中的应用。附图说明图1、典型细胞亚克隆形态(×250)(A、B、C、D60min；a、b、c、d48h)：图1A&1a:细胞呈块状，细胞长成单层后，细胞饱满界限清晰；图1B&1b:细胞以铺路石样形态汇合呈单层，细胞饱满界限清晰，继续培养细胞会分裂变小，但细胞界限仍旧清晰；图1C&c:细胞则在汇合后连接成片，继续培养，细胞界限开始模糊；图1D&d:细胞呈长棒状、放射样生长。图2、软琼脂克隆形成检测图3、备选单克隆细胞株的支原体检测图4、备选单克隆细胞株外源因子检定图5、15D3和6A8单克隆细胞核型分析：图5A:15D3P72,图5B:15D3P92,图5C:6A8P71,图5D:6A8P91图6、MDCK-6A8细胞在含血清和不含血清培养基中生长曲线图7、MDCK-15D3细胞在含血清和不含血清培养基中生长曲线图8、H1N1在15D3细胞上种毒后收获液的血凝滴度图9、H3N2在MDCK-15D3细胞上种毒后收获液的血凝滴度图10、B型流感病毒在MDCK-15D3细胞上种毒后收获液的血凝滴度图11、H5N1在MDCK-15D3细胞上种毒后收获液的血凝滴度图12、H1N1流感病毒在MDCK-6A8细胞上种毒后收获液的血凝滴度图13、H3N2在MDCK-6A8细胞上种毒后收获液的血凝滴度图14、B型流感病毒在MDCK-6A8细胞上种毒后收获液的血凝滴度图15、H5N1在MDCK-6A8细胞上种毒后收获液的血凝滴度具体实施方式细胞、病毒株及培养材料1、细胞：MDCKCCL-34细胞(P55)购自ATCC。2、流感病毒：季节性流感病毒为H1N1(NIB-74XP)、H3N2(NIB-79)和B(BX-51B)，大流行流感病毒为禽流本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种广谱低致瘤性MDCK细胞系，所述的细胞系为MDCK‑15D3和MDCK‑6A8，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C2017155和CCTCC NO:C2017154，地址，湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，邮编430072，电话027‑68752319。

【技术特征摘要】
1.一种广谱低致瘤性MDCK细胞系，所述的细胞系为MDCK-15D3和MDCK-6A8，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:C2017155和CCTCCNO:C2017154，地址，湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，邮编430072，电话027-68752319。2.权利要求1所述的MDCK-15D3、MDCK-6A8细胞株在制备流感病毒疫苗中的应用，所述的流感病毒优选为H1N1、H3N2、B、H5N1，最优选的，所述的流感病毒细胞株为季节性流感病毒为H1N1(NIB-74XP)、...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨晓明，黄晓媛，刘洋，罗建，施金荣，张家友，赵巍，王英，韩锡鑫，邱阿明，韩静，程健曦，乐欣如，鲁建忠，段凯，李新国，
申请(专利权)人：武汉生物制品研究所有限责任公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42