一种耐热柯萨奇病毒制造技术

本发明专利技术涉及病毒学技术领域，具体涉及一种耐热柯萨奇病毒

【技术实现步骤摘要】
一种耐热柯萨奇病毒A组10型热稳定株及其应用


[0001]本专利技术涉及病毒学
，具体涉及一种耐热柯萨奇病毒
A
组
10
型
(CV
‑
A10)
热稳定株及其应用
。

技术介绍

[0002]手足口病
(Hand
‑
foot
‑
and
‑
mouth disease
，
HFMD)
由多种肠道病毒引起，以肠道病毒
A71
型
(EV
‑
A71)、
柯萨奇病毒
A16
型
(CV
‑
A16)、
柯萨奇病毒
A6
型
(CV
‑
A6)、
柯萨奇病毒
A10
型
(CV
‑
A10)
等最为常见
。
[0003]CV
‑
A10
属于小
RNA
病毒科肠道病毒属，肠道病毒颗粒呈二十面体球形对称，直径约为
27
‑
30nm
，基因组为约
7400nt
的单股正链
RNA。CV
‑
A10
病毒结构蛋白由前体蛋白经蛋白酶作用剪切为
VP4、VP2、VP3、VP1
组成，
VP1
‑
VP3
>位于病毒粒子的表面，
VP4
与病毒
RNA
相连位于病毒粒子的内部
。
肠道病毒存在空心颗粒
(EP)
和实心颗粒
(FP)
两种不同沉降系数的病毒颗粒，
EP
包含
VP0、VP2、VP3
三种结构蛋白，不具有感染性，
FP
包含
VP1
～
VP4
四种结构蛋白，
VP0
成熟剪切为
VP4
和
VP2
后，病毒颗粒
(Virion,FP)
内部包含病毒
RNA
，是具有感染性的成熟病毒颗粒
。
[0004]有研究表明，热稳定性株的免疫原性较热不稳定性株强，能刺激动物产生更高水平的中和抗体
。

技术实现思路

[0005]基于此，本专利技术以分离于
2017
年中国湖北省襄阳市手足口病患者
HEV3108
号样品中的毒株
CV
‑
A10
‑
3108/CHN XY/2017(CV
‑
A10
‑
3018
‑
TS
‑
，简称为
TS
‑
)
作为母株，将其在
Vero
细胞上分离，经多次传代形成多基因型的准种群库，在连续5轮，
52℃
半小时热处理选择压力下，适应传代，再经空斑克隆纯化获得4株热稳定株
TS
+
，分别为
CV
‑
A10
‑
3108
‑
TS
+Ⅰ(
简称
TS
+Ⅰ)、CV
‑
A10
‑
3108
‑
TS
+Ⅱ(
简称
TS
+Ⅱ)、CV
‑
A10
‑
3108
‑
TS
+Ⅲ(
简称
TS
+Ⅲ)
和
CV
‑
A10
‑
3108
‑
TS
+Ⅳ(
简称
TS
+Ⅳ)
，其稳定性相对于热不稳定株有明显提升，且抗原产量与免疫原性优于或不劣于热不稳定母株，可以作为灭活疫苗候选株，并且其序列可用于后续肠道病毒
VLP
疫苗的研发以及肠道病毒稳定性相关基础研究和应用
。
[0006]本专利技术的目的之一在于提供一种在
52℃
处理
30min
后仍能在细胞上增殖且病毒颗粒产量和体液免疫原性优于或不劣于热不稳定住的病毒株，并对其影响病毒株热稳定性的核苷酸和氨基酸位点进行定位，具体地在于保护一种一种耐热柯萨奇病毒
A
组
10
型热稳定株，所述耐热柯萨奇病毒
A
组
10
型稳定株能够耐受
52℃
以下的高温处理，其蛋白质序列如
SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8
任一项所示
。
[0007]即与野生型毒株相比，存在如下
(1)
～
(4)
任一项所述的位点突变：
[0008](1)VP4
蛋白中
N69S、VP2
蛋白中
L194V、VP1
蛋白中
E40G、2B
蛋白中
I57V、3A
蛋白中
I44M
；
[0009](2)VP2
蛋白中
L194V、VP1
蛋白中
E40G、2B
蛋白中
I57V、3A
蛋白中
I44M
；
[0010](3)VP2
蛋白中
L194V、VP1
蛋白中
E40G、2A
蛋白中
E85G、2B
蛋白中
I57V、2A
蛋白中
L141S、2C
蛋白中
V232I、3A
蛋白中
I44M
；
[0011](4)VP2
蛋白中
L194V、VP1
蛋白中
E40G、VP1
蛋白中
T103A、2B
蛋白中
I57V、2A
蛋白中
L141S、3A
蛋白中
I44M。
[0012]其中，所述野生型毒株的蛋白质序列如
SEQ ID NO:1
所示，其中
VP4
蛋白为
SEQ ID NO:1
所示序列的第1～
69
位所示氨基酸序列，
VP2
蛋白为
SEQ ID NO:1
所示序列的第
70
～
324
位所示氨基酸序列，
VP3
蛋白为
SEQ ID NO:1
所示序列的第
325
～
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种耐热柯萨奇病毒
A
组
10
型热稳定株，其特征在于，所述耐热柯萨奇病毒
A
组
10
型稳定株能够耐受
52℃
以下的高温处理，其蛋白质序列与野生型毒株相比，存在如下
(1)
～
(4)
任一项所述的位点突变：
(1)VP4
蛋白中
N69S、VP2
蛋白中
L194V、VP1
蛋白中
E40G、2B
蛋白中
I57V、3A
蛋白中
I44M
；
(2)VP2
蛋白中
L194V、VP1
蛋白中
E40G、2B
蛋白中
I57V、3A
蛋白中
I44M
；
(3)VP2
蛋白中
L194V、VP1
蛋白中
E40G、2A
蛋白中
E85G、2B
蛋白中
I57V、2A
蛋白中
L141S、2C
蛋白中
V232I、3A
蛋白中
I44M
；
(4)VP2
蛋白中
L194V、VP1
蛋白中
E40G、VP1
蛋白中
T103A、2B
蛋白中
I57V、2A
蛋白中
L141S、3A
蛋白中
I44M
；其中，所述野生型毒株的蛋白质序列如
SEQ ID NO:1
所示，其中
VP4
蛋白为
SEQ ID NO:1
所示序列的第1～
69
位所示氨基酸序列，
VP2
蛋白为
SEQ ID NO:1
所示序列的第
70
～
324
位所示氨基酸序列，
VP3
蛋白为
SEQ ID NO:1
所示序列的第
325
～
564
位所示氨基酸序列，
VP1
蛋白为
SEQ ID NO:1
所示序列的第
565
～
862
位所示氨基酸序列，
2A
蛋白为
SEQ ID NO:1
所示序列的第
863
～...

【专利技术属性】
技术研发人员：申硕，李松壮，杜亚鑫，刘睿伦，孟胜利，郭靖，王泽鋆，
申请(专利权)人：武汉生物制品研究所有限责任公司，
类型：发明
国别省市：