一种鸭肝微粒体的制备方法技术

本发明专利技术提供一种鸭肝微粒体的制备方法，包括步骤：（a）断头处死实验鸭，无菌条件下，清洗液灌洗肝脏；（b）取出肝脏，离体灌洗肝脏，进一步清洗肝中残血；（c）按一定的肝湿重比加入预冷的匀浆缓冲液，充分剪碎，冰浴中匀浆；（d）将肝脏匀浆液低速离心，分别收集上清和沉淀，沉淀加入一定量预冷的匀浆缓冲液重悬，超声破碎，肝脏匀浆液经冷冻高速离心后收集上清；（e）转移至超速离心管中，超速离心后弃上清，加入储存液重悬，再次超速离心，所得沉淀经储存液重悬分装；（f）HPLC检测鸭肝微粒体亚型酶CYP3A4和CYP2E1的活性。

A preparation method of duck liver microsomes

The present invention provides a preparation method of duck liver microsomes, including steps: (a) breaking the head and killing experimental ducks, under aseptic conditions, washing the liver by cleaning liquid; (b) taking out the liver, washing the liver in vitro, further cleaning the liver and residual blood; (c) adding the pre cooled homogenate buffer according to a certain liver wet weight ratio, fully shredding, ice In the bath homogenate (d), the liver homogenate was centrifuged at low speed, collecting the supernatant and precipitating respectively, adding a certain amount of pre cooled homogenate buffer to heavy suspension, ultrasonic crushing, and collecting the liver homogenate after freezing high speed centrifugation; (E) transferred to the supersonic centrifuge tube, after the overspeed was removed from the heart, and the storage solution was suspended again. After subcentrifugation, the precipitates were repacked by storage solution. (f) HPLC was used to detect the activities of CYP3A4 and CYP2E1 in duck liver microsomal subtypes.

【技术实现步骤摘要】
一种鸭肝微粒体的制备方法
本专利技术属于蛋白酶学领域，具体涉及一种鸭肝微粒体的制备方法。
技术介绍
鸭肝微粒体是鸭肝脏内质网膜的亚细胞组分，富含大量的药物代谢酶：细胞色素P450酶。细胞色素P450酶广泛的参与了类固醇、胆酸、脂肪酸、前列腺素、白三烯、生物胺以及类维生素等物质的生物合成和代谢；因此，常用作体外研究药物代谢和药物相互作用的主要工具。有关禽类动物肝微粒体鲜有报道，本专利技术旨在提供一种简单易操作的鸭肝微粒体制备方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是建立一种鸭肝微粒体的制备方法。为了解决上述所涉及到的问题，本专利技术采取如下方法制备鸭肝微粒体：鸭肝微粒体制备方法的步骤包括：（a）断头处死实验鸭，无菌条件下，清洗液灌洗肝脏；（b）取出肝脏，离体灌洗肝脏，进一步清洗肝中残血；（c）按一定的肝湿重比加入预冷的匀浆缓冲液，充分剪碎，冰浴中匀浆；（d）将肝脏匀浆液低速离心，分别收集上清和沉淀，沉淀加入一定量预冷的匀浆缓冲液重悬，超声破碎，肝脏匀浆液经冷冻高速离心后收集上清；（e）转移至超速离心管中，超速离心后弃上清，加入储存液重悬，再次超速离心，所得沉淀经储存液重悬分装；（f）HPLC检测鸭肝微粒体亚型酶CYP3A4和CYP2E1的活性。可选的鸭为体重为1-1.5kg，21-30日龄龄的雄性鸭；可选的灌洗肝脏用的清洗液为10mMPBS（含0.15MKCl和0.2%尼克酰胺，pH7.4）；可选的肝湿重比的比例为1:2-1:3；可选的匀浆缓冲液为含0.15MKCl、1mMEDTA、1mMPMSF的0.05MTris-HCL（pH7.4）；可选的加入预冷的匀浆缓冲液的量是沉淀重量的1-2倍；可选的超声破碎的功率为180-250W、超声时间为4-5s，间隔时间为8-10s，超声次数为15-20次；可选的超速离心的速度为100000×g，首次超速离心的时间为75min，再次超速离心的时间为45min；可选的储存液为含0.25M蔗糖、20%甘油、1mMEDTA和0.15MKCl的0.1M磷酸缓冲液（pH7.4）。附图说明图1：HPLC检测鸭肝微粒体CYP3A4活性的峰图图2：HPLC检测鸭肝微粒体CYP2E1活性的峰图图3：鸭肝微粒体CYP3A4和CYP2E1反应速率图具体实施方式为了使本专利技术的目的及优势更清新地展现，现将具体实施方式进一步阐述。此处所阐述的具体实施方式仅针对本专利技术进行解释，并不用于限定本专利技术。本专利技术选择体重为1.5kg的雄性30日龄的麻鸭制备鸭肝微粒体。具体操作如下：1、禁食，正常饮水24h后断头处死实验鸭；2、在无菌条件下剖腹，用预冷的含0.15MKCl和0.2%尼克酰胺，pH为7.4的10mMPBS经肝门静脉灌洗法除去肝中残血；3、剪下肝脏，继续用预冷清洗液离体灌注肝脏进一步洗去肝中残血；4、将清洗干净的肝脏放置冰上预冷的离心管中，称重，然后将其按1:2-1:3的肝湿重比加入预冷的匀浆缓冲液中，充分剪碎，然后在冰浴中匀浆；5、将匀浆好的组织液，倒入预冷50mL的离心管中，4℃，1500rpm离心5min，收集上清；6、将沉淀用1:1-1:2匀浆缓冲液重悬，超声破碎，功率180-250W，超声时间为4-5s，间隔时间为8-10s，超声次数为15-20次；7、将收集的上清于冷冻高速离心机9000×g离心15-20min，收集上清液；8、将转移至超速离心管中，100000×g离心75min，弃上清，加1/4原上清体积的储存液重悬，转移至新的超速离心管中，100000×g再次离心45min，得到沉淀，加约1.5倍肝重体积的储存液重悬，即为肝微粒体；9、鸭肝微粒体亚型酶CYP3A4和CYP2E1活性检测：10、鸭肝微粒体亚型酶CYP3A4活性检测：在200μM底物睾酮中加入肝微粒体（0.1mg/mL），pH7.4的PBS缓冲液补足500μL，37℃预孵育5min，加入终浓度为1mM的NADPH再生系统启动反应。37℃水浴20min后，加入0.5mL冰冷乙酸乙酯（含内标非那西丁），斡旋终止反应，12000r/min离心10min，取上清上机检测，流动相为水-乙腈=50:50，检测波长为254nm，柱温为25℃，流速为1ml/min，色谱柱为HypersilC18（250mm×4.6mm、5μm）；11、鸭肝微粒体亚型酶CYP2E1活性检测：在300μM底物氯唑沙宗中加入肝微粒体（0.1mg/mL），pH7.4的PBS缓冲液补足500μL，37℃预孵育5min，加入终浓度为1mM的NADPH再生系统启动反应。37℃水浴40min后，加入0.5mL冰冷乙酸乙酯（含内标非那西丁），斡旋终止反应，12000r/min离心10min，取上清上机检测，流动相为甲醇-乙腈-水=40:20:40，检测波长为296nm，柱温为30℃，流速为1ml/min，色谱柱为HypersilC18（250mm×4.6mm、5μm）。以上已经对本专利技术创造的较佳实施例进行详细阐述，但本专利技术创造不限定于上述实施例，凡在本专利技术的精神和原则之内作出任何修改，等同替换和改进等，均应包含在本专利技术的保护范围内。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鸭肝微粒体的制备方法，其特征在于：（a）断头处死实验鸭，无菌条件下，清洗液灌洗肝脏；（b）取出肝脏，离体灌洗肝脏，进一步清洗肝中残血；（c）按一定的肝湿重比加入预冷的匀浆缓冲液，充分剪碎，冰浴中匀浆；（d）将肝脏匀浆液低速离心，分别收集上清和沉淀，沉淀加入一定量预冷的匀浆缓冲液重悬，超声破碎，肝脏匀浆液经冷冻高速离心后收集上清；（e）转移至超速离心管中，超速离心后弃上清，加入储存液重悬，再次超速离心，所得沉淀经储存液重悬分装；（f）HPLC检测鸭肝微粒体亚型酶CYP3A4和CYP2E1的活性。

【技术特征摘要】
1.一种鸭肝微粒体的制备方法，其特征在于：（a）断头处死实验鸭，无菌条件下，清洗液灌洗肝脏；（b）取出肝脏，离体灌洗肝脏，进一步清洗肝中残血；（c）按一定的肝湿重比加入预冷的匀浆缓冲液，充分剪碎，冰浴中匀浆；（d）将肝脏匀浆液低速离心，分别收集上清和沉淀，沉淀加入一定量预冷的匀浆缓冲液重悬，超声破碎，肝脏匀浆液经冷冻高速离心后收集上清；（e）转移至超速离心管中，超速离心后弃上清，加入储存液重悬，再次超速离心，所得沉淀经储存液重悬分装；（f）HPLC检测鸭肝微粒体亚型酶CYP3A4和CYP2E1的活性。2.根据权利要求1所述的一种鸭肝微粒体制备方法，其特征在于，所述的步骤a中实验鸭为体重为1-1.5kg，21-30日龄龄的雄性鸭。3.根据权利要求1所述的一种鸭肝微粒体制备方法，其特征在于，所述的步骤a中灌洗肝脏用的清洗液为10mMPBS（含0.15MKCl和0.2%尼克酰胺，pH7.4）。4.根据权利要求1所述的一种鸭肝微粒体制备方法，其特征在于，所述的步骤c中肝湿重比的比例为1:2-1...

【专利技术属性】
技术研发人员：张清，蒋敏，齐来俊，
申请(专利权)人：江苏齐氏生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32