一种肝微粒体中6α-羟基紫杉醇浓度的UPLC/MS/MS检测方法技术

本发明专利技术公开了一种肝微粒体中6α-羟基紫杉醇浓度的UPLC/MS/MS检测方法，包括以下步骤：(1)建立肝微粒体温孵体系，加入内标物系列浓度的6α-羟基紫杉醇对照品，制备标准曲线样品；(2)将标准曲线样品注入UPLC/MS/MS液质联用仪进行检测；根据检测结果得到6α-羟基紫杉醇的标准曲线；(3)按照步骤(1)相同的方法制备待测样品，将待测样品注入UPLC/MS/MS液质联用仪，按照步骤(2)相同的条件进行检测，根据标准曲线得到待测样品中的6α-羟基紫杉醇浓度。本发明专利技术检测方法分析时间短、灵敏度高、进样量小，符合方法学验证要求，适用于肝微粒体温孵样本中6α-羟基紫杉醇浓度的测定，具有广泛的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种肝微粒体中6α-羟基紫杉醇浓度的UPLC/MS/MS检测方法
本专利技术涉及药物的检测方法，具体涉及肝微粒体中6α-羟基紫杉醇浓度的UPLC/MS/MS检测方法。
技术介绍
CYP450酶是参与药物代谢的主要酶系，包括CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4等与药物代谢密切相关的同工酶。研究表明，大部分药物-药物相互作用的发生与CYP450酶活性的诱导和抑制相关，其中主要由酶抑制引起。利用体外方法进行药物代谢研究，可有效缩短新药研发周期，直接观察酶对底物的选择性代谢和底物对酶的诱导和抑制，确定药物代谢途径，预测体内潜在的药物相互作用。目前，常用的体外方法为探针药物法，该方法通过建立肝微粒体温孵体系，从而建立了药物代谢研究模型。6α-羟基紫杉醇是CYP2C8探针底物紫杉醇的代谢产物。因此，目前亟需一种肝微粒体中6α-羟基紫杉醇浓度的检测方法。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术提供了一种肝微粒体中6α-羟基紫杉醇浓度的UPLC/MS/MS检测方法，包括以下步骤：(1)建立肝微粒体温孵体系，加入内标物和系列浓度的6α-羟基紫杉醇对照品，制备标准曲线样品；(2)将标准曲线样品注入UPLC/MS/MS液质联用仪进行检测；色谱条件如下：色谱柱：C18色谱柱；流动相：流动相A为0.1％甲酸水溶液，流动相B为0.1％甲酸乙腈溶液；梯度洗脱条件为：运行时间为3分钟；质谱条件如下：离子源：电喷雾离子源；检测方式：正离子多反应监测；根据检测结果得到6α-羟基紫杉醇的标准曲线；(3)按照步骤(1)相同的方法，将底物紫杉醇与肝微粒体温孵体系共温孵，制备得到含有内标物的待测样品，将待测样品注入UPLC/MS/MS液质联用仪，按照步骤(2)相同的条件进行检测，根据标准曲线得到待测样品中的6α-羟基紫杉醇浓度。其中，温孵的时间为20min。优选地，所述内标物为邻甲苯海拉明。优选地，所述色谱条件中，流动相的流速为0.3mL/min。优选地，所述色谱条件中，柱温为40℃。优选地，所述色谱条件中，色谱柱为ACQUITYUPLC-BEHC18色谱柱，规格为1.7μm,2.1×50mm。优选地，所述色谱条件中，进样量为1μL。优选地，所述正离子多反应监测中，6α-羟基紫杉醇的母离子-子离子对为m/z870.41→m/z286.05，锥孔电压为9V，碰撞电压为16V；邻甲苯海拉明的母离子-子离子对为m/z270.10→m/z181.08，锥孔电压为15V，碰撞电压为12V。优选地，所述质谱条件中，毛细管电压为3000V，离子源温度为150℃，去溶剂化温度为350℃，去溶剂化气体流速为650L/h。优选地，所述质谱条件中，锥孔气体流速为150L/h，雾化气压力为6.0bar。优选地，所述步骤(1)的标准曲线样品制备方法为：将6α-羟基紫杉醇加入肝微粒体温孵体系，所述肝微粒体温孵体系包含肝微粒体、葡萄糖-6-磷酸、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、MgCl2、PBS和NADP，再加入含内标的甲醇溶液，混匀，离心，取上清液，即得标准曲线样品。其中，标准曲线样品的制备可以按照下述方法进行：分别将系列浓度的对照标准品6α-羟基紫杉醇加入肝微粒体温孵体系(包含肝微粒体、葡萄糖-6-磷酸、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、MgCl2、PBS和NADP)，再加入含内标的甲醇溶液，充分混匀3min，于4℃，13000rpm离心10min，取上清液即得。肝微粒可以采用人、大鼠、小鼠、犬、恒河猴、食蟹猴的肝微粒。本专利技术专一地检测对肝微粒体中的6α-羟基紫杉醇浓度，色谱分析时间仅需3分钟，进样量仅需1μL，分析时间短、灵敏度高、进样量小。同时，本专利技术检测方法专属性强、基质效应小、线性和范围广、批内和批间准确度与精密度高、进样盘稳定性高、工作液稳定性高，符合方法学验证要求，适用于肝微粒体温孵样本中6α-羟基紫杉醇浓度的测定，具有广泛的应用前景。显然，根据本专利技术的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本专利技术上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。以下通过实施例形式的具体实施方式，对本专利技术的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本专利技术上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本专利技术上述内容所实现的技术均属于本专利技术的范围。附图说明所用肝微粒体为人肝微粒体。图1为母离子和锥孔电压的优选结果。图2的质谱条件为：离子对：m/z870.41→m/z105.07，锥孔电压9V，碰撞电压46V。图3的质谱条件为：离子对：m/z870.41→m/z122.09，锥孔电压9V，碰撞电压32V。图4的质谱条件为：离子对：m/z870.41→m/z286.05，锥孔电压9V，碰撞电压16V，也即本专利技术的质谱条件。图5空白样本的色谱图。图6LLOQ(定量下限)样本色谱图。图7为待测样本色谱图。图8为6α-羟基紫杉醇典型标准曲线。具体实施方式实施例1所述试剂和仪器均来自市售的商品。1、对照品及内标6α-羟基紫杉醇(OH-TX)：分子量869.91，纯度95％，批号3-WXT-24-2(TCR)；柠檬酸邻甲苯海拉明(IS,正离子内标)：纯度99％，批号048F0510V(sigma-aldrich)。2、主要仪器3、试验所用主要软件UNIFI1.6.1：UPLC/MS/MS数据采集及浓度计算。4、检测方法(1)制备对照样品，加入内标物；(2)将对照样品注入UPLC/MS/MS液质联用仪进行检测；检测条件如下：色谱柱：ACQUITYUPLC-BEHC18,1.7μm,2.1×50mm(Waters公司)流动相：A：0.1％甲酸水溶液B：0.1％甲酸乙腈溶液流速：0.3mL/min柱温：40℃进样盘温度：4℃离子源：电喷雾离子化源(ESI)；内标(IS)：10ng/mL邻甲苯海拉明甲醇溶液梯度洗脱：进样量：1μL运行时间：3min保留时间：tR(OH-TX)≈1.70min；tR(IS)≈1.57min毛细管电压(Capillaryvoltage)：3.00kV离子源温度(SourceTemperature)：150℃去溶剂化温度(DesolvationTemperature)：350℃去溶剂化气体流速(Desolvationgasflow)：650L/h锥孔气体流速(Conegasflow)：150L/h雾化气压力(Nebulizergaspressure)：6.0bar检测方式：正离子多反应监测(MRM)离子对：m/z870.41→m/z286.05(OH-TX)，m/z270.10→m/z181.08(IS)锥孔电压(Conevoltage)：9V(OH-TX)和15V(IS)碰撞电压(Collisionenergy)：16V(OH-TX)和12V(IS)根据检测结果得到6α-羟基紫杉醇的标准曲线；(3)按照步骤(1)相同的方法，将底物紫杉醇与肝微粒体温孵体系共温孵20min，制备得到含有内标物的待测样品，将待测样品注入UPLC/MS/MS液质联用仪，按照步骤(2)相同的条件进行检测，根据标准曲线得到待测样品中的6α-羟基紫杉醇浓度。在确定本专利技术的检测方法各项工艺参数中，专利技术人对本专利技术方法的色谱条件和质本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种肝微粒体中6α‑羟基紫杉醇浓度的UPLC/MS/MS检测方法，包括以下步骤：(1)建立肝微粒体温孵体系，加入内标物和系列浓度的6α‑羟基紫杉醇对照品，制备标准曲线样品；(2)将标准曲线样品注入UPLC/MS/MS液质联用仪进行检测；色谱条件如下：色谱柱：C18色谱柱；流动相：流动相A为0.1％甲酸水溶液，流动相B为0.1％甲酸乙腈溶液；梯度洗脱条件为：运行时间为3分钟；质谱条件如下：离子源：电喷雾离子源；检测方式：正离子多反应监测，监测的离子对为：6α‑羟基紫杉醇的母离子‑子离子对和内标物的母离子‑子离子对；根据检测结果得到6α‑羟基紫杉醇的标准曲线；(3)按照步骤(1)相同的方法，将底物紫杉醇与肝微粒体温孵体系共温孵，制备得到含有内标物的待测样品，将待测样品注入UPLC/MS/MS液质联用仪，按照步骤(2)相同的条件进行检测，根据标准曲线得到待测样品中的6α‑羟基紫杉醇浓度。

【技术特征摘要】
1.一种肝微粒体中6α-羟基紫杉醇浓度的UPLC/MS/MS检测方法，包括以下步骤：(1)建立肝微粒体温孵体系，加入内标物和系列浓度的6α-羟基紫杉醇对照品，制备标准曲线样品；(2)将标准曲线样品注入UPLC/MS/MS液质联用仪进行检测；色谱条件如下：色谱柱：ACQUITYUPLC-BEHC18色谱柱，规格为1.7μm,2.1×50mm；流动相：流动相A为0.1％甲酸水溶液，流动相B为0.1％甲酸乙腈溶液；流动相的流速为0.3mL/min；梯度洗脱条件为：运行时间为3分钟；质谱条件如下：毛细管电压为3000V，离子源温度为150℃，去溶剂化温度为350℃，去溶剂化气体流速为650L/h，锥孔气体流速为150L/h，雾化气压力为6.0bar；离子源：电喷雾离子源；检测方式：正离子多反应监测，监测的离子对为：6α-羟基紫杉醇的母离子-子离子对和内标物的母离子-子离子对；根据检测结果得到6α-羟基紫杉醇的标准曲线；(3)按照步骤(1)相同的方法，将底物紫杉醇与肝微粒体温孵体系共温孵...

【专利技术属性】
技术研发人员：岑小波，赖力，肖媛媛，龚梅，曾强，
申请(专利权)人：成都华西海圻医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：四川;51