本发明专利技术公开了一种茶叶多糖单糖组成的快速定量方法，其步骤：（1）将茶叶多糖用三氟乙酸水解；（2）将水解后的茶叶多糖样品用超纯水溶解得到水解多糖溶液，加入海藻糖作为内标物；（3）将含内标的水解多糖溶液用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）衍生化；（4）在水解多糖衍生化的同时进行标准单糖的衍生化；（5）进行高效液相色谱分析，得到各个单糖的含量。本方法所用高效液相检测系统条件为：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，流动相为按一定比例混合的缓冲溶液与有机溶剂，流速为1.0ml/min，紫外检测器，检测波长250nm。方法易行、快速方便、稳定，达到了在20min内进行单糖的分离与分析，提高了茶多糖单糖检测的准确度与精确度。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于茶叶化学领域，更具体涉及。
技术介绍
茶多糖是（Tea Polysaccharide)是茶叶中重要的活性物质，具有免疫、降血糖、防 福射、抗氧化、降血脂等多种功能。 茶多糖是一种酸性糖蛋白，其活性与分子量大小和单糖组成有着密切的联系。检 测茶多糖的单糖组成对研究其生物活性有很大的帮助。多糖中单糖组成的检测方法主要 包含显色法、毛细管电泳法、气相色谱法、薄层层析色谱法、液相色谱法等。苏冰霞（山苦 茶多糖的分离和含量测定，2012,热带作物学报，Vol. 33(3) :567-571)、傅博强（茶叶中多 糖含量的测定，2001，食品科学，22(11) :69-73)等人的非专利文献表明，显色法只能测定 茶多糖中总糖的含量，并不能定量分析茶多糖的单糖组成；丁侃（多糖类药物的毛细管电 泳分析方法及其应用，1999,色谱，Vol. 17(4) :346-252)、张丽芝（单糖组成分析方法的研 究进展，2013,微生物学免疫学进展，Vol. 41 (1)77-81)等人的非专利文献表明，利用毛细管 电泳分离多糖组成，多糖的分离度较差；丁婧思（茶叶酸性多糖的分离、纯化以及理化性质 研究，2014,食品科学，Vol. 35(23) :57-60)、陈海霞（高活性茶多糖的一级结构表征、空间 构象及生物活性的研究，2002,华中农业大学）等人的非专利文献表明，气相色谱法中由于 单糖并不易挥发，导致衍生化过程复杂且不稳定，衍生后容易产生异构体，且不能检测糖醛 酸含量；颜军（TLC快速分析多糖的单糖组成，2006,食品科学，Vol. 27 (12) :603-607)等人 的非专利文献表明，薄层析法灵敏度比较低，分析不精确；屠幼英（绿茶饮料中茶多糖的构 成，2001，茶叶，Vol. 27(2) :22-24)等人的非专利文献表明，普通液相色谱法分析要采用糖 柱或氨基柱，价格昂贵且维护费用较高，而且需要很长时间来平衡。邓静（高效液相色谱法 和化学计量学在白茶及其多糖质量控制中的应用，2014,南昌大学）、郭威（柱前衍生HPLC 法分析普洱茶多糖的单糖组成，农业科学与技术，2013, Vol. 14(4) :556-558)等人的非专 利文献利用柱前衍生HPLC法分析白茶、普洱茶多糖的单糖组成，但分析时间在40min以上， 且部分单糖间分离效果有待提高。显然，如何找到一种分析时间更快，分离效果更好的方 法用于茶叶多糖中单糖组成的分析显得十分必要。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术的不足，是在于提供了一种茶叶多糖单糖组成的定 量方法，方法易行、快速、方便、稳定，使其达到了在20min内进行单糖的分离与分析，分离 效果及精密度明显优于现行方法，提高了茶多糖单糖检测的准确度。 为了实现上述的目的，本专利技术通过以下技术方案实现： ，其步骤包括现将茶多糖进行酸水解，然后进 行衍生化，其步骤还包括以海藻糖为内标物，利用高效液相色谱仪进行分析与检测，在此过 程中将所述的单糖快速分离与定量分析。 -种茶叶多糖单糖组成的快速定量方法，其步骤如下： (1) 将茶叶多糖置于安瓿管中，加入一定量的2. Omol/L的三氟乙酸，真空封管后于 130°C下水解120分钟，冷却至室温后氮气吹干，得到水解多糖样品； (2) 将水解多糖用超纯水充分溶解，加入海藻糖作为内标物，得到含内标的水解多糖溶 液； (3) 在含内标的水解多糖溶液100 μ L中按照体积比1 :2 :3的比例依次加入0. 5mol/ L 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP)甲醇溶液200 μ L和0. 3mol/L氢氧化钠溶液 (NaOH) 300 μ L，均匀混合后在70°C水浴反应60分钟进行衍生化，将反应液冷却至室温，用 0. 3mol/L HCL溶液300 μ L中和，得到衍生化多糖溶液； (4) 在多糖衍生化的同时进行标准单糖的衍生化，即先用超纯水配置0. lmol/L的单糖 溶液，然后取等量单糖溶液混合成单糖标准品混合液，按照步骤（3)进行标准单糖和标准 单糖混合液的衍生化，得到衍生化标准单糖和衍生化混合标准单糖溶液； (5) 在衍生化多糖、衍生化标准单糖和衍生化混合标准单糖溶液中分别加入氯仿萃取， 上清液经0. 45 μ m微孔滤膜过滤，得到HPLC分析样； (6) HPLC分析条件为：采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；流动相A选用磷 酸二氢钾-三乙胺与乙腈组成的缓冲溶液；流动相B选用乙腈；洗脱过程采用梯度洗脱，从 0-20分钟，流动相B相应的浓度为6% -12% ;柱温35°C，流速为1.0 ml/min，紫外检测器， 波长250nm ; (7) 根据图谱中各单糖保留时间进行茶叶多糖中所含单糖的定性分析，根据图谱中各 单糖峰面积大小进行茶叶多糖中所含单糖的定量分析。 本专利技术与现有技术相比，具有以下积极效果： 1、提高单糖的分离效果：可一次性分离茶多糖中所含单糖，包括葡萄糖醛酸和半乳糖 醛酸，各单糖峰峰型尖锐，分离效果显著。 2、分析时间缩短：利用本专利技术提供的HPLC分析条件，可在20min内完成单糖的分 尚与分析。 此外，所使用的设备比较常见，方法容易实现，检测成本较低。 通过查阅，经检索到与本专利技术相关的非专利文献10余篇，本专利技术与相关文献主要 技术特征和实施效果的比较见表1 一表4。技术方案不同，所达到的技术效果不一样，本发 明通过现有技术相比，都远远高于现有技术的效果。利用本专利技术技术可以一次性完成茶叶 多糖中单糖的组成分析，分离时间控制在20min内；各单糖组均分具有良好的线性关系，相 关系数达到0. 998以上；各单糖组分保留时间与峰面积CV%均小于3. 75,精密度高；各单 糖组分的回收率在93. 6% -102. 6%之间，准确度高。【附图说明】 图1为一种标准单糖样品HPLC检测色谱图。 图2为一种茶叶多糖HPLC检测色谱图。 其中：1 一甘露糖、2 -核糖、3 -鼠李糖、4 一葡萄糖醛酸、5 -半乳糖醛酸、6 -葡 萄糖、7 -木糖、8 -半乳糖、9 一阿拉伯糖、10 -海藻糖。【具体实施方式】 实施例1 : ，其步骤如下： (1) 将茶叶多糖IOmg置于安瓿管中，加入一定量的2. Omol/L的三氟乙酸，真空封管后 于130°C下水解120分钟，冷却至室温后氮气吹干，得到水解多糖； (2) 将水解多糖用超纯水充分溶解，加入海藻糖作为内标物，得到含内标的水解多糖溶 液； (3) 在含内标的水解多糖溶液100 μ L中按照体积比1 :2 :3的比例依次加入0. 5mol/L 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP)甲醇溶液200 μ L和0· 3mol/L NaOH溶液300 μ L，均 匀混合后在70°C水溶液中反应60分钟进行衍生化，将反应液冷却至室温，用0. 3mol/L HCL 溶液300 μ L中和，得到衍生化多糖溶液； (4) 在多糖衍生化的同时进行标准单糖的衍生化，即先用超纯水配置0. lmol/L的单糖 溶液，然后取等量单糖溶液混合成单糖标准品混合液，按照上述方法（3)进行标准单糖和 标准单糖混合液的衍生化，得到衍生化标准单糖和衍生化混合标准单糖溶液； (5) 在衍生化多糖、衍生化标准单本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种茶叶多糖单糖组成的快速定量方法，其步骤是：（1）将茶叶多糖置于安瓿管中，加入一定量的2.0 mol/L的三氟乙酸溶液，真空封管后于130℃下水解120分钟，冷却至室温后氮气吹干，得到水解多糖样品；（2）将水解多糖样品用超纯水充分溶解，加入海藻糖作为内标物，得到含内标的水解多糖溶液；（3）在含内标的水解多糖溶液100μL中按照体积比1：2：3的比例依次加入 0.5mol/L 1‑苯基‑3‑甲基‑5‑吡唑啉酮甲醇溶液200μL和0.3 mol/L NaOH溶液300μL，均匀混合后在70℃水浴反应60分钟进行衍生化，将反应液冷却至室温，用0.3 mol/L HCL溶液300μL中和，得到衍生化多糖溶液；（4）在水解多糖衍生化的同时进行标准单糖的衍生化，先用超纯水配置0.1 mol/L的单糖溶液，然后取等量单糖溶液混合成单糖标准品混合液，按照步骤（3）进行标准单糖和标准单糖混合液的衍生化，得到衍生化标准单糖和衍生化混合标准单糖；（5）在衍生化多糖、衍生化标准单糖和衍生化混合标准单糖溶液中分别加入氯仿萃取，上清液经0.45μm微孔滤膜过滤，得到HPLC分析样；（6）HPLC分析条件为：采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；流动相A选用磷酸二氢钾‑三乙胺与乙腈组成的缓冲溶液；流动相B选用纯乙腈；洗脱过程采用梯度洗脱，从0‑20分钟，流动相B相应的浓度为6%‑12%；柱温 35℃，流速为1.0 ml/min，紫外检测器，波长250 nm；（7）根据图谱中各单糖保留时间进行茶叶多糖中所含单糖的定性分析，根据图谱中各单糖峰面积大小进行茶叶多糖中所含单糖定量分析。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：艾于杰，倪德江，余志，陈玉琼，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。