本发明专利技术公开了一种肝微粒体中羟基安非他酮浓度的UPLC/MS/MS检测方法，包括以下步骤：(1)建立肝微粒体温孵体系，加入内标物和系列浓度的羟基安非他酮对照品，制备标准曲线样品；(2)将标准曲线样品注入UPLC/MS/MS液质联用仪进行检测；根据检测结果得到羟基安非他酮的标准曲线；(3)按照步骤(1)相同的方法制备待测样品，将待测样品注入UPLC/MS/MS液质联用仪，按照步骤(2)相同的条件进行检测，根据标准曲线得到待测样品中的羟基安非他酮浓度。本发明专利技术检测方法分析时间短、灵敏度高、进样量小，符合方法学验证要求，适用于肝微粒体温孵样本中羟基安非他酮浓度的测定，具有广泛的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及药物的检测方法，具体涉及肝微粒体中羟基安非他酮浓度的UPLC/MS/ MS检测方法。
技术介绍
CYP450酶是参与药物代谢的主要酶系，包括CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、 CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4等与药物代谢密切相关的同工酶。研究表明，大部分药物-药 物相互作用的发生与CYP450酶活性的诱导和抑制相关，其中主要由酶抑制引起。利用体外 方法进行药物代谢研究，可有效缩短新药研发周期，直接观察酶对底物的选择性代谢和底 物对酶的诱导和抑制，确定药物代谢途径，预测体内潜在的药物相互作用。目前，常用的体 外方法为探针药物法，该方法通过建立肝微粒体温孵体系，从而建立了药物代谢研究模型。 羟基安非他酮（2S，3S-Hydroxybupropione)是CYP2B6探针底物安非他酮的代谢 产物。因此，目前亟需一种肝微粒体中羟基安非他酮浓度的检测方法。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术提供了一种肝微粒体中羟基安非他酮浓度的UPLC/MS/MS 检测方法，包括以下步骤： (1)建立肝微粒体温孵体系，加入内标物和系列浓度的羟基安非他酮对照品，制备 标准曲线样品； 2)将标准曲线样品注入UPLC/MS/MS液质联用仪进行检测； 色谱条件如下： 色谱柱：C18色谱柱； 流动相：流动相A为0. 1 %甲酸水溶液，流动相B为0. 1 %甲酸乙腈溶液； 梯度洗脱条件为： 运行时间为3分钟； 质谱条件如下： 离子源：电喷雾离子源； 检测方式：正离子多反应监测； 根据检测结果得到羟基安非他酮的标准曲线； ⑶按照步骤⑴相同的方法，将底物安非他酮与肝微粒体温孵体系共温孵，制备 得到含有内标物的待测样品，将待测样品注入UPLC/MS/MS液质联用仪，按照步骤（2)相同 的条件进行检测，根据标准曲线得到待测样品中的羟基安非他酮浓度。 其中，温孵的时间为20min。 优选地，所述内标物为邻甲苯海拉明。 优选地，所述色谱条件中，流动相的流速为0. 3mL/min。 优选地，所述色谱条件中，柱温为40°C。 优选地，所述色谱条件中，色谱柱为ACQUITYUPLC-BH1C18色谱柱，规格为 1. 7μm, 2. 1X50mm〇 优选地，所述色谱条件中，进样量为0. 2μL。 优选地，所述正离子多反应监测中，羟基安非他酮的母离子-子离子对为m/ z256. 08 -m/z238. 02,锥孔电压为15V，碰撞电压为14V;邻甲苯海拉明的母离子-子离子 对为m/z270. 10 -m/z181.08，锥孔电压为15￥，碰撞电压为12￥。 优选地，所述质谱条件中，毛细管电压为3000V，离子源温度为150°C，去溶剂化温 度为350°C，去溶剂化气体流速为650L/h。 优选地，所述质谱条件中，锥孔气体流速为150L/h，雾化气压力为6.Obar。 优选地，所述步骤（1)的标准曲线样品制备方法为：将羟基安非他酮加入肝微粒 体温孵体系，所述肝微粒体温孵体系包含肝微粒体、葡萄糖-6-磷酸、葡萄糖-6-磷酸脱氢 酶、MgCl2、PBS和NADP，再加入含内标的乙腈溶液，混匀，离心，取上清液，即得标准曲线样 品。 其中，标准曲线样品的制备可以按照下述方法进行：分别将系列浓度的对照标准 品羟基安非他酮加入肝微粒体温孵体系（包含肝微粒体、葡萄糖-6-磷酸、葡萄糖-6-磷酸 脱氢酶、MgCl2、PBS和NADP)，再加入含内标的乙腈溶液，充分混匀3min，于4°C，13000rpm离 心lOmin，取上清液即得。肝微粒可以采用人、大鼠、小鼠、犬、恒河猴、食蟹猴的肝微粒。 本专利技术专一地检测对肝微粒体中的羟基安非他酮浓度，色谱分析时间仅需3分 钟，进样量仅需0.2μL，分析时间短、灵敏度高、进样量小。同时，本专利技术检测方法专属性强、 基质效应小、线性范围广、批内和批间准确度与精密度高、进样盘稳定性高、工作液稳定性 高，符合方法学验证要求，适用于肝微粒体温孵样本中羟基安非他酮浓度的测定，具有广泛 的应用前景。 显然，根据本专利技术的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离 本专利技术上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。 以下通过实施例形式的【具体实施方式】，对本专利技术的上述内容再作进一步的详细说 明。但不应将此理解为本专利技术上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本专利技术上述内容 所实现的技术均属于本专利技术的范围。【附图说明】 所用肝微粒体为人肝微粒体。 图1为母离子和锥孔电压的优选结果。 图2的质谱条件为：离子对：m/z256. 08 -m/z238. 02,锥孔电压15V，碰撞电压 14V，也即本专利技术的质谱条件。 图3的质谱条件为：离子对：m/z256. 08 -m/z131. 09 ;锥孔电压15V;碰撞电压 26V〇 图4的质谱条件为：离子对：m/z256. 08 -m/z131. 09 ;锥孔电压15V;碰撞电压 26V〇 图5为空白样本的色谱图。 图6为LL0Q(定量下限）样本色谱图。 图7为待测样本色谱图。 图8为羟基安非他酮典型标准曲线。【具体实施方式】 实施例1 所述试剂和仪器均来自市售的商品。 1、对照品及内标(2S，3S)-羟基安非他酮盐酸盐（0Η-ΒΡ):分子量292. 20,纯度99 %，批号 041M4728V(sigma-aldrich)； 柠檬酸邻甲苯海拉明（IS，正离子内标）：纯度99 %，批号 048F0510V(sigma-aldrich)。 2、主要仪器 3、试验所用主要软件 UNIFI1. 6. 1 :UPLC/MS/MS数据采集及浓度计算。 4、检测方法 (1)建立肝微粒体温孵体系，加入内标物和系列浓度的羟基安非他酮对照品，制备 标准曲线样品； (2)将标准曲线样品注入UPLC/MS/MS液质联用仪进行检测；检测条件如下： 色谱柱：ACQUITYUPLC-BEHC18, 1. 7μm, 2. 1X50mm(Waters公司） 流动相：A:0. 1 %甲酸水溶液 B:0· 1 %甲酸乙腈溶液 流速： 0· 3mL/min 柱温： 40°C 进样盘温度：4°C 离子源： 电喷雾离子化源（ESI); 内标（IS) :50ng/mL邻甲苯海拉明乙腈溶液 梯度洗脱： 进样量： 0· 2μL 运行时间： 3min 保留时间：t_HBP)~1. 42min;t[；(15)~1. 57min 毛细管电压（Capillaryvoltage) : 3.OOkV 离子源温度（SourceTemperature) : 150°C 去溶剂化温度（DesolvationTemperature) : 350°C 去溶剂化气体流速（Desolvationgasflow) : 650L/h 锥孔气体流速（Conegasflow) : 150L/h 雾化气压力（Nebulizergaspressure) : 6.Obar 检测方式：正离子多反应监测（MRM) 离子对：m/z256. 08 -m/z238. 02 (0Η-ΒΡ)，m/z270. 10 -m/z181. 08 (IS) 锥孔电压（Conevoltage) :15V(0Η-ΒΡ)和 15V(IS)本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种肝微粒体中羟基安非他酮浓度的UPLC/MS/MS检测方法，包括以下步骤：(1)建立肝微粒体温孵体系，加入内标物和系列浓度的羟基安非他酮对照品，制备标准曲线样品；(2)将标准曲线样品注入UPLC/MS/MS液质联用仪进行检测；色谱条件如下：色谱柱：C18色谱柱；流动相：流动相A为0.1％甲酸水溶液，流动相B为0.1％甲酸乙腈溶液；梯度洗脱条件为：运行时间为3分钟；质谱条件如下：离子源：电喷雾离子源；检测方式：正离子多反应监测；根据检测结果得到羟基安非他酮的标准曲线；(3)按照步骤(1)相同的方法，将底物安非他酮与肝微粒体温孵体系共温孵，制备得到含有内标物的待测样品，将待测样品注入UPLC/MS/MS液质联用仪，按照步骤(2)相同的条件进行检测，根据标准曲线得到待测样品中的羟基安非他酮浓度。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：岑小波，赖力，肖媛媛，龚梅，曾强，
申请(专利权)人：成都华西海圻医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：四川;51
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