测定肝微粒体中NNK代谢物的液质联用方法，属于生物化学分析领域，具体为一种分析测定肝微粒体中4-(甲基亚硝基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)代谢物的液质联用方法。本发明专利技术方法主要包括以下步骤：（1）肝微粒体孵育体系的配制；（2）样品处理：（3）样品分析，通过液质联用方法进行肝微粒体中NNK代谢物测定。本发明专利技术的优点在于：前处理简单、分析速度快、选择性好、检测灵敏度高，且可分析比较NNK在不同种属肝微粒体中的代谢。可以为进一步研究NNK及其他亚硝胺化合物的体内外代谢奠定方法学基础，具有重要意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物化学分析领域，具体为一种分析测定肝微粒体中4_(甲基亚硝基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)代谢物的液质联用方法。
技术介绍
NNK可诱导实验动物产生多种癌症，国际癌症研究组织(IARC)将它定为一类致癌物(Smokeless tobacco and tobacco-specific nitrosamines. IARC monographs on the evaluation of carcinogenic risks to humans, vol. 89. Lyon (FR): IARCj 2007.)。 生物实验表明NNK是大鼠肺癌的强烈致癌剂(Brunnemann K，Hoffmann D. Analytical studies on tobacco-specific N-nitrosamines in tobacco and tobacco smoke. Critical reviews in toxicology, 1991，21 (4) : 235-240·)。NNK 不论以何种途径处理实验动物，均能诱发实验动物肺癌的发生，且多数为肺腺癌(Hecht S S. Biochemistry, Biology, and Carcinogenicity of Tobacco-Specific N-Nitrosamines. Chemical Research in Toxicology , 1998, 11 (6): 559-603.)。NNK需要通过代谢活化才能表现其致癌性，NNK和它的主要代谢物NNAL代谢活化为DNA加合物对它们致癌性的表达非常关键。NNK和NNAL的代谢、加合物形成和脱毒反应现在已了解得比较清楚，它们在人类和啮齿类动物中有很多相同的反应，但是存在量的差异(Hoffmann D, Hecht S S. Advances in tobacco carcinogenesis. In Handbook of Experimental Pharmacology (Cooper C S, and Grover P L, Eds. ). Springer-Verlag, Heidelberg, 1990: 63-102.)。对NNK进行体内体外代谢研究可以进一步阐明烟草引发癌症的机制，并为后续癌症预防研究提供技术支持。肝微粒体是指肝细胞被勻浆破碎时，内膜系统的膜结构破裂后自己重新封闭起来的小囊泡(主要是内质网和高尔基体)，这些小囊泡的直径大约100 nm左右，是异质性的集合体。在体外试验中，具有蛋白质合成、蛋白质糖基化和脂类合成等基本功能。肝微粒体在药物代谢研究中应用广泛，可以进行细胞色素酶(CYP)反应表型研究，基于CYP的药物相互作用研究，以及代谢稳定性的研究，目前已越来越多的运用肝微粒体体外温孵法预测药物在体内的代谢清除，一般通过测定药物体外代谢酶促动力学，运用合理的药代动力学模型来推断体内药物的代谢清除。对于NNK代谢物的检测，文献报道多采用NNK标记，液相色谱法(HPLC法) 分析(Hecht S S. Metabolism of 4-(Methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)- 1-butanone by Cultured Monkey Lung Explants. Drug Metabolism and Disposition, 2000, 28(1): 5-9. ；Berhard Schrader, Hirsch-Ernst, Ekkehard scholz, et al. Metabolism of 4- (Methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone in primary cultures of rat alveolar type II cells. Drug Metabolism and Disposition, 2000, 28(2): 180-185. ；Mullett W Μ, Levsen K, Borlak J, et al. Automated in-tube solid-phase microextraction coupled with HPLC for the determination of N-nitrosamines incell cultures , Analytical Chemistry, 2002，74(7) : 1695-1701)。同位素放射性标记试验需具备相应的安全防护措施和条件，每次试验或阶段性试验结束后，都可能有不同程度的放射性污染和放射性废物的出现，要面临去污染处理和放射性废物处理等问题， 近年来应用日益受限。且建立的HPLC法分析时间长，峰形质量不高，分离效果不佳。因此建立一种对所有NNK代谢物都适用且简单快速、选择性好、检测灵敏度高的液质联用方法， 并将之应用于肝微粒体体系进行分析，可以为进一步研究NNK及其他亚硝胺化合物的体内外代谢奠定方法学基础，具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对上述现有分析技术的不足，提供一种快速、灵敏、实用的同时测定肝微粒体中7种NNK代谢物的液质联用方法。其特点是前处理简单、分析速度快、选择性好、检测灵敏度高，且可分析比较NNK在不同种属肝微粒体中的代谢。本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的来实现的 测定肝微粒体中NNK代谢物的液质联用方法，包括以下步骤(1)肝微粒体孵育体系的配制孵育取离心管，依次加入孵育液B，孵育液A，所需浓度的NNK Γ使NNK终浓度为 0. 5-200 μ Mol)，补加磷酸盐缓冲溶液配成肝微粒体孵育体系；反应将离心管置于37.0 °C水浴中5 min，加入肝微粒体，轻摇孵育体系使之均勻后不再晃动，置于37. 0 ！水浴中静止反应30 min ；(2)样品处理取出反应产物，加入预冷的内标乙腈溶液(三种氘代内标NNK-d4、 HPB-d4、NNAL-d3使内标的最终含量水平为Ing/mL，但本实验所选内标浓度是根据具体实验决定的，可根据实际需要选定)终止反应，放于4°C冰箱中保存60 min使蛋白沉淀，3500 rpm 离心10 min,取上清再于10000 rpm离心5 min,上清液过0. 22 μ m滤膜后进样2 μ L分析；(3)样品分析，进行肝微粒体中NNK代谢物测定，具体条件如下 色谱条件色谱柱Waters Atlantis HILIC Silica柱(3.0X100 mm, 3 μ m，美国 Waters 公司)； 流动相A 水(含10 mM甲酸铵)，B 乙腈；流速500 μ L/min ；洗脱方式梯度洗脱，具体条件如表1所示；进样量2 μ L ；柱温26 0C ； 表1 :ΝΝΚ代谢物液相色谱梯度洗脱条件权利要求1.测定肝微粒体中NNK代谢物的液质联用方法，其特征在于包括以下步骤(1)肝微粒体孵育体系的配制孵育取离心管，依次加入孵育液B，孵育液A，所需浓度的NNK，补加磷酸盐缓冲溶液配成肝微粒体孵育体系；反应将离心管置于37.0 °C水浴中5 min，加入肝微粒体，轻摇孵育体系使之均勻后不再晃动，置于37. 0 ！水浴中静止反应30 min本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张建勋，王娟，卢斌斌，王昇，赵贝贝，宗永立，李鹏，孙世豪，
申请(专利权)人：中国烟草总公司郑州烟草研究院，
类型：发明
国别省市：
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