一种诱导性多能干细胞向成熟内皮细胞高效分化的方法技术

本发明专利技术公开了一种诱导性多能干细胞向成熟内皮细胞高效分化的方法，属于细胞工程技术领域。其包括如下步骤：诱导多能干细胞预处理培养；诱导形成侧板中胚层细胞；诱导形成内皮细胞倾向的内皮祖细胞；诱导形成成熟内皮细胞。本发明专利技术通过增减搭配多种细胞诱导因子，并在诱导方法上进行合理升级，可以高效诱导诱导多能干细胞向内皮细胞定向分化，在采用少量诱导多能干细胞且不需要纯化操作的条件下，即可获得大量纯度高、功能完善的成熟内皮细胞。

Efficient differentiation of induced pluripotent stem cells into mature endothelial cells

The invention discloses a method for highly efficient differentiation of induced pluripotent stem cells into mature endothelial cells, belonging to the field of cell engineering technology. It includes the following steps: induced pluripotent stem cell preconditioning culture; induced formation of lateral mesodermal cells; induced formation of endothelial progenitor cells prone to endothelial cells; induced formation of mature endothelial cells. The present invention can efficiently induce pluripotent stem cells to differentiate into endothelial cells by adding or subtracting a variety of cell inducing factors, and reasonably upgrade the inducing methods. A large number of mature endothelial cells with high purity and perfect function can be obtained by using a small amount of induced pluripotent stem cells without purification operation. Cells.

【技术实现步骤摘要】
一种诱导性多能干细胞向成熟内皮细胞高效分化的方法
本专利技术涉及一种诱导性多能干细胞向成熟内皮细胞高效分化的方法，属于细胞工程

技术介绍
血管内皮细胞(VascularEndothelialCells，vEC)是组成血管内壁的一层特异性扁平上皮细胞，是维持全身血液循环系统稳定状态的重要保障。在糖尿病、高血压及其它慢性病理中，经常伴随有内皮细胞功能失调或损伤，极易诱发动脉粥样硬化、甚至心肌梗死等心血管疾病，严重威胁患者生命健康。因此，调节修复或替换损伤的血管内皮，对于预防和治疗心血管疾病具有重要的临床价值。研究指出，具备完善功能的成熟血管内皮细胞可以在机体血管梗死区域重新形成血管组织，有效解决局部缺血症状。另外，由成熟血管内皮细胞在体外形成的血管结构也有极大潜力取代常规静脉分离手段，为心血管疾病患者进行心脏搭桥手术提供适用性更强的替代材料。但如何获得大量具备成管能力的成熟血管内皮细胞，目前仍处于研究摸索阶段，这也就直接限制了其在临床应用上的顺利开展。作为再生医学发展过程中的重中之重，诱导性多能干细胞(inducedpluripotentstemcells,iPSC)的出现，为内皮细胞(EndothelialCells，EC)的临床应用提供了一条具有高度可行性的方案。诱导多能干细胞成功地绕开了免疫原性和伦理性两个最关键的问题，而且来源广泛，可以通过建立患者特定的诱导多能干细胞进而完成个体化治疗。采用患者来源的诱导多能干细胞在体外诱导扩增来获得大量成熟血管内皮细胞，有助于顺利跨过EC临床应用的高门槛，同时也可为将来针对内皮细胞的基因治疗做好准备。近几年相关研究领域发展迅速，目前多种诱导多能干细胞诱导分化为成熟内皮细胞的方法被相继提出，包括早期的3D拟胚体诱导法[1]和近期的2D直接诱导法[2-4]，均采用一系列内皮分化所需诱导因子进行多重组合，都能够在一定程度上诱导诱导多能干细胞向成熟内皮细胞分化。但这些诱导方法也都有一定的局限性，比如诱导周期长(普遍需要9-20天)、转化效率低(20％-60％)、纯化过程繁琐(需经MACS或流式进行筛选)、内皮功能不完善(体外或体内成管能力欠缺)等等。鉴于此，要想真正得到临床应用级别的内皮细胞，还需要进一步摸索优化诱导多能干细胞向内皮细胞诱导分化的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供一种诱导性多能干细胞向成熟内皮细胞高效分化的方法。本专利技术通过增减搭配多种细胞诱导因子，并在诱导方法上进行合理升级，可以高效诱导诱导多能干细胞向内皮细胞定向分化，在采用少量诱导多能干细胞且不需要纯化操作的条件下，即可获得大量纯度高、功能完善的成熟内皮细胞。同时，整个诱导过程耗时短，操作简单，不涉及动物源性细胞和成分，大大提高了诱导多能干细胞来源的内皮细胞的高效性、功能性、安全性，为利用患者自身的诱导多能干细胞大规模生产临床应用级别的成熟内皮细胞提供了一种新的途径和方法。本专利技术解决上述技术问题的技术方案如下：一种诱导性多能干细胞向成熟内皮细胞高效分化的方法，包括如下步骤：步骤1：将诱导性多能干细胞进行预处理，得到细胞重悬液；步骤2：将步骤1得到的细胞重悬液，按照每1cm2的细胞培养板底面积铺种2万-5万个细胞的比例，移入含有TeSR-E8培养基和ROCK抑制剂Y27632的混合物的细胞培养板中，置于细胞培养箱中培养16-24小时；步骤3：移去步骤2中细胞培养板中旧培养基，按照每10cm2的细胞培养板底面积加液量为4mL的比例，加入第一N2B27胰岛素缺失培养基，置于细胞培养箱中培养16-24小时；步骤4：移去步骤3中细胞培养板中的旧培养基，并用PBS冲洗细胞培养板，按每10cm2的细胞培养板底面积加液量为6mL的比例，加入第二N2B27胰岛素缺失培养基，置于细胞培养箱中培养48小时，在细胞培养板中得到侧板中胚层细胞；步骤5：移去步骤4中含有侧板中胚层细胞的细胞培养板中的旧培养基，并用PBS冲洗细胞培养板，按照每10cm2的细胞培养板底面积加液量为4mL的比例，加入第一StemPro-34培养基，然后置于细胞培养箱中培养16-24小时，重复步骤5操作一次，在细胞培养板中诱导得到含有内皮细胞倾向的内皮祖细胞；步骤6：移去步骤5中含有内皮细胞倾向的内皮祖细胞的细胞培养板中的旧培养基，并用PBS冲洗细胞培养板，按照每10cm2的细胞培养板底面积加液量为0.5mL的比例，加入细胞分解酶混合液，进行酶解，得到酶解后含有内皮细胞倾向的内皮祖细胞；步骤7：将步骤6得到的酶解后含有内皮细胞倾向的内皮祖细胞，按照每10cm2的细胞培养板底面积加液量为1mL的比例，加入第二StemPro-34培养基，得到含有内皮细胞倾向的内皮祖细胞重悬液；步骤8：将步骤7得到的含有内皮细胞倾向的内皮祖细胞重悬液，按照每1cm2的细胞培养板底面积铺种3万-6万个细胞的比例，移入含有第二StemPro-34培养基的细胞分化培养板中，置于细胞培养箱中培养16-24小时；步骤9：移去步骤8中细胞培养板中的旧培养基，并用PBS冲洗细胞培养板，按照每10cm2的细胞培养板底面积加液量为2mL的比例，加入第二StemPro-34培养基，置于细胞培养箱中，培养48小时，即得到成熟诱导分化内皮细胞。与现有技术相比，本专利技术的方法，不再需要纯化步骤，所得成熟内皮细胞纯度高达96％以上，降低了操作难度，同时减少纯化步骤对细胞状态的干扰。以6孔细胞培养板为例，每孔起始铺种30-35万个诱导多能干细胞，在诱导第9天可收获400-500万个成熟内皮细胞，是现有技术内皮细胞产量的2-3倍。采用本专利技术的方法，诱导9天，获得的内皮细胞/起始诱导多能干细胞转化比例可达15/1，也是现有技术内皮细胞/诱导多能干细胞转化比例的2-3倍。本专利技术所得成熟内皮细胞具备显著的体外成管能力。其中，步骤3中，移去步骤2中细胞培养板中旧培养基，具体的操作方法为：倾斜培养板，用移液器将旧培养基吸出。步骤4中、步骤5中、步骤6中、步骤9中，移去细胞培养板中的旧培养基的方法，同上述步骤3中移去细胞培养板中的旧培养基的方法。步骤5中，内皮祖细胞，即Endothelialprogenitorcell,简称EPC。在上述技术方案的基础上，本专利技术还可以做如下改进。进一步，步骤1中，所述将诱导性多能干细胞进行预处理，得到细胞重悬液的方法为：在细胞培养板里，将诱导性多能干细胞复苏、传代后，用PBS冲洗2次，再按照每10cm2的细胞培养板底面积加液量为0.5mL的比例，加入37℃预热过的细胞消化液进行酶解消化，得到酶解消化液；待70-80％的诱导性多能干细胞开始脱落时，加入上述酶解消化液5倍体积的DMEM/F12培养基进行中和，然后将诱导性多能干细胞转移到离心管中，离心，移去上清，加入TeSR-E8培养基，重悬细胞沉淀，得到细胞重悬液。其中，上述DMEM/F12培养基，购自LifeTechnologies公司,型号为11039021。更进一步，所述诱导性多能干细胞复苏、传代的方法为：复苏前一天准备好基底膜基质包被的细胞培养板，置于细胞培养箱中，过夜孵育，得到过夜孵育后的基底膜基质包被过的细胞培养板；从液氮中取出冻存的诱导多能干细胞，接种于上述过夜孵育后的基底膜基质包被过本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种诱导性多能干细胞向成熟内皮细胞高效分化的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1：将诱导性多能干细胞进行预处理，得到细胞重悬液；步骤2：将步骤1得到的细胞重悬液，按照每1cm2的细胞培养板底面积铺种2万‑5万个细胞的比例，移入含有TeSR‑E8培养基和ROCK抑制剂Y27632的混合物的细胞培养板中，置于细胞培养箱中培养16‑24小时；步骤3：移去步骤2中细胞培养板中旧培养基，按照每10cm2的细胞培养板底面积加液量为4mL的比例，加入第一N2B27胰岛素缺失培养基，置于细胞培养箱中培养16‑24小时；步骤4：移去步骤3中细胞培养板中的旧培养基，并用PBS冲洗细胞培养板，按每10cm2的细胞培养板底面积加液量为6mL的比例，加入第二N2B27胰岛素缺失培养基，置于细胞培养箱中培养48小时，在细胞培养板中得到侧板中胚层细胞；步骤5：移去步骤4中含有侧板中胚层细胞的细胞培养板中的旧培养基，并用PBS冲洗细胞培养板，按照每10cm2的细胞培养板底面积加液量为4mL的比例，加入第一StemPro‑34培养基，然后置于细胞培养箱中培养16‑24小时，重复步骤5操作一次，在细胞培养板中诱导得到含有内皮细胞倾向的内皮祖细胞；步骤6：移去步骤5中含有内皮细胞倾向的内皮祖细胞的细胞培养板中的旧培养基，并用PBS冲洗细胞培养板，按照每10cm2的细胞培养板底面积加液量为0.5mL的比例，加入细胞分解酶混合液，进行酶解，得到酶解后含有内皮细胞倾向的内皮祖细胞；步骤7：将步骤6得到的酶解后含有内皮细胞倾向的内皮祖细胞，按照每10cm2的细胞培养板底面积加液量为1mL的比例，加入第二StemPro‑34培养基，得到含有内皮细胞倾向的内皮祖细胞重悬液；步骤8：将步骤7得到的含有内皮细胞倾向的内皮祖细胞重悬液，按照每1cm2的细胞培养板底面积铺种3万‑6万个细胞的比例，移入含有第二StemPro‑34培养基的细胞分化培养板中，置于细胞培养箱中培养16‑24小时；步骤9：移去步骤8中细胞培养板中的旧培养基，并用PBS冲洗细胞培养板，按照每10cm2的细胞培养板底面积加液量为2mL的比例，加入第二StemPro‑34培养基，置于细胞培养箱中，培养48小时，即得到成熟诱导分化内皮细胞。...

【技术特征摘要】
1.一种诱导性多能干细胞向成熟内皮细胞高效分化的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1：将诱导性多能干细胞进行预处理，得到细胞重悬液；步骤2：将步骤1得到的细胞重悬液，按照每1cm2的细胞培养板底面积铺种2万-5万个细胞的比例，移入含有TeSR-E8培养基和ROCK抑制剂Y27632的混合物的细胞培养板中，置于细胞培养箱中培养16-24小时；步骤3：移去步骤2中细胞培养板中旧培养基，按照每10cm2的细胞培养板底面积加液量为4mL的比例，加入第一N2B27胰岛素缺失培养基，置于细胞培养箱中培养16-24小时；步骤4：移去步骤3中细胞培养板中的旧培养基，并用PBS冲洗细胞培养板，按每10cm2的细胞培养板底面积加液量为6mL的比例，加入第二N2B27胰岛素缺失培养基，置于细胞培养箱中培养48小时，在细胞培养板中得到侧板中胚层细胞；步骤5：移去步骤4中含有侧板中胚层细胞的细胞培养板中的旧培养基，并用PBS冲洗细胞培养板，按照每10cm2的细胞培养板底面积加液量为4mL的比例，加入第一StemPro-34培养基，然后置于细胞培养箱中培养16-24小时，重复步骤5操作一次，在细胞培养板中诱导得到含有内皮细胞倾向的内皮祖细胞；步骤6：移去步骤5中含有内皮细胞倾向的内皮祖细胞的细胞培养板中的旧培养基，并用PBS冲洗细胞培养板，按照每10cm2的细胞培养板底面积加液量为0.5mL的比例，加入细胞分解酶混合液，进行酶解，得到酶解后含有内皮细胞倾向的内皮祖细胞；步骤7：将步骤6得到的酶解后含有内皮细胞倾向的内皮祖细胞，按照每10cm2的细胞培养板底面积加液量为1mL的比例，加入第二StemPro-34培养基，得到含有内皮细胞倾向的内皮祖细胞重悬液；步骤8：将步骤7得到的含有内皮细胞倾向的内皮祖细胞重悬液，按照每1cm2的细胞培养板底面积铺种3万-6万个细胞的比例，移入含有第二StemPro-34培养基的细胞分化培养板中，置于细胞培养箱中培养16-24小时；步骤9：移去步骤8中细胞培养板中的旧培养基，并用PBS冲洗细胞培养板，按照每10cm2的细胞培养板底面积加液量为2mL的比例，加入第二StemPro-34培养基，置于细胞培养箱中，培养48小时，即得到成熟诱导分化内皮细胞。2.根据权利要求1所述的一种诱导性多能干细胞向成熟内皮细胞高效分化的方法，其特征在于，步骤1中，所述将诱导性多能干细胞进行预处理，得到细胞重悬液的方法为：在细胞培养板里，将诱导性多能干细胞复苏、传代后，用PBS冲洗2次，再按照每10cm2的细胞培养板底面积加液量为0.5mL的比例，加入37℃预热过的细胞消化液进行酶解消化，得到酶解消化液；待70-80％的诱导性多能干细胞开始脱落时，加入上述酶解消化液5倍体积的DMEM/F12培养基...

【专利技术属性】
技术研发人员：顾雨春，张会远，谭声江，
申请(专利权)人：北京呈诺医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11