培养基及其应用与诱导性多能干细胞向胰岛分化的方法技术

本发明专利技术涉及干细胞技术领域，尤其涉及培养基及其应用与诱导性多能干细胞向胰岛分化的方法。本发明专利技术提供的分化方法中，从iPS干细胞到胰腺祖细胞的分化过程需要14天(2周)的时间。主要分为四个步骤：定向内胚层

【技术实现步骤摘要】
培养基及其应用与诱导性多能干细胞向胰岛分化的方法


[0001]本专利技术涉及干细胞
，尤其涉及培养基及其应用与诱导性多能干细胞向胰岛分化的方法。

技术介绍

[0002]糖尿病(Diabetes Mellitus,DM)是一种因多种遗传因素和环境因素共同作用而导致的胰岛素产生不足或功能缺陷，并以血糖异常升高为主要特征的内分泌代谢紊乱疾病。由于血液中葡萄糖累积过多，还会引发各种致病因子作用于机体的各大靶器官导致一系列并发症的形成。糖尿病是世界公认的顽疾之一，已经成为世界第三大慢性疾病和第五大致死性疾病。
[0003]据世界卫生组织推荐的分型，可将糖尿病分为以胰岛素绝对不足为主的I型糖尿病和以胰岛素相对不足且胰岛素抵抗为主的II型糖尿病两种类型。其中，约10％的患者属于I型糖尿病，遗传因素在该型糖尿病中的重要性高达50％，发病常见于儿童和青少年人群。另外，90％的患者属于II型糖尿病，是一种多基因遗传因素、环境因素联合作用引起的代谢性疾病，具有很高的遗传倾向，多见于40岁以上的成年患者。
[0004]目前在糖尿病的临床治疗上，通过注射胰岛素来控制血糖虽然是一种有效的缓解措施，但并不能彻底治愈糖尿病，还有可能造成低血糖等风。真正根治糖尿病将是恢复机体内功能性胰岛β细胞的数量和消除糖尿病引发的各种并发症。其中，进行胰岛移植是治疗I型糖尿病和部分II型糖尿病最有效的方法之一。但是，由于供体来源严重不足以及器官移植将面临终身免疫抑制治疗等问题，极大地限制了胰岛移植在临床治疗上的广泛应用。近年来，诱导多能干细胞的出现为再生医学提供了一个全新的治疗策略，而由干细胞体外定向诱导分化成胰腺祖细胞和功能性胰岛的出现也为我们提供了一个全新的细胞替代疗法。
[0005]iPS细胞，英文全称为Induced pluripotent stemcells，中文全称是诱导性多能干细胞，是由体细胞诱导而成的干细胞，具有和胚胎干细胞类似的发育多潜能性。iPS细胞的获得方法相对简单和稳定，不使用胚胎细胞或卵细胞，不仅在伦理上占有优势，更扩大了干细胞的来源范围，使更多患者能够有机会利用iPS技术获得所需的干细胞。但目前对于如何将iPS细胞分化为胰岛的研究尚不足。干细胞体外定向诱导和分化的过程就是在模拟体内正常生理情况下组织器官的发生和发育过程。但由于诱导的过程往往分成诺干阶段，同时分化的时间长，因此实际操作过程中，往往重复性低，诱导效率差，副产品多严重影响了诱导胰岛的临床应用。

技术实现思路

[0006]有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供培养基及其应用与诱导性多能干细胞向胰岛分化的方法，该方法转化效率高、操作便捷，且全程无动物源组分添加。
[0007]本专利技术从iPS到胰岛的体外诱导分化过程采用分步诱导方法，一共分七个阶段，定向内胚层的诱导分化、原肠管的诱导分化、后前肠的诱导分化、胰腺祖细胞的诱导分化、内
分泌前体细胞的诱导分化、早期胰岛的诱导分化、晚期成熟胰岛的诱导分化这7个步骤，最终可以得到大量成熟胰岛。
[0008]在iPS向内胚层分化阶段，本专利技术提供了：
[0009]GDF8在制备促进iPS细胞向内胚层细胞分化的制剂中的应用。
[0010]所述制剂为培养基或培养基添加物，当所述制剂为培养基时，GDF8作为组分之一存在于培养基中；当所述制剂为培养基添加物时，GDF8独立存在，或与辅料共同存在，在诱导时添加入培养基中，作为诱导iPS细胞向内胚层细胞分化的诱导剂。所述辅料包括但不限于水。
[0011]一种培养基，由基础培养基、GDF8和CHIR-99021、碳酸氢钠、谷氨酰胺(GlutaMax)、葡萄糖、脱脂BSA(胎牛白蛋白)组成。
[0012]在此培养基中，所述Stage1基础培养基为MCDB131培养基。
[0013]所述MCDB131培养基为液体培养基或粉末培养基。当其为粉末培养基时以无菌水或MCDB131培养基稀释，使用滤器灭菌。
[0014]在此培养基(Stage 1培养基A)中，所述GDF8的浓度为80ng/mL～120ng/mL；所述CHIR-99021的浓度为2μmol/L～4μmol/L；所述碳酸氢钠的浓度为2g/L～4g/L、所述谷氨酰胺的浓度为1mmol/L～3mmol/L、所述葡萄糖的浓度为15mmol/L～25mmol/L、所述BSA的质量分数为1％～3％。
[0015]一些具体实施例中，培养基(Stage 1培养基A)中，所述GDF8的浓度为100ng/mL；所述CHIR-99021的浓度为3μmol/L；所述碳酸氢钠的浓度为3g/L、所述谷氨酰胺的浓度为2mmol/L、所述葡萄糖的浓度为20mmol/L、所述BSA的质量分数为2％。
[0016]在此培养基(Stage 1培养基B)中，所述GDF8的浓度为80ng/mL～120ng/mL；所述碳酸氢钠的浓度为2g/L～4g/L、所述谷氨酰胺的浓度为1mmol/L～3mmol/L、所述葡萄糖的浓度为15mmol/L～25mmol/L、所述BSA的质量分数为1％～3％。
[0017]一些具体实施例中，培养基(Stage 1培养基B)中，所述GDF8的浓度为100ng/mL；所述碳酸氢钠的浓度为3g/L、所述谷氨酰胺的浓度为2mmol/L、所述葡萄糖的浓度为20mmol/L、所述BSA的质量分数为2％。
[0018]此培养基在诱导iPS细胞向内胚层细胞分化中的应用。
[0019]一种诱导iPS细胞向内胚层细胞分化的方法，以上述的培养基诱导iPS细胞向内胚层细胞分化。
[0020]所述诱导的容器经过Matrigel基质铺板，所述铺板的条件为：E8完全培养基存在条件下，37℃，5％CO2静置1-2d。
[0021]所述诱导的时间为3d，诱导第1天使用Stage 1培养基A；诱导第2～3天，使用Stage1培养基B，每天更换新鲜培养基。
[0022]经过诱导分化的iPS细胞形态发生改变，相比于未分化的干细胞，此时内胚层细胞的核质比显著降低，并且细胞之间接触之处存在明显界限。
[0023]iPS经诱导后，用SOX17(绿色)、FOXA2(红色)作为内胚层的标记物(图5)，内胚层的阳性率要高于85％，本专利技术实施例中，诱导后获得的内胚层细胞经检测SOX17/DAPI(免疫荧光)，表达率>90％，FOXA2/DAPI(免疫荧光)，表达率>90％。研究表明，采用GDF8、CHIR-99021联合对iPS进行诱导，诱导的效率更高，所得内胚层细胞的数量大、SOX17及FOXA2的阳性率
更高，显著高于单独采用GDF8或CHIR-99021，p<0.05。
[0024]在内胚层向原肠管分化阶段，本专利技术提供了：
[0025]FGF7和/或抗坏血酸在制备促进内胚层细胞向原肠管分化的制剂中的应用。
[0026]所述制剂为培养基或培养基添加物，当所述制剂为培养基时，FGF7和/或抗坏血本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.GDF8在制备促进iPS细胞向内胚层细胞分化的制剂中的应用。2.一种培养基，其特征在于，由MCDB131培养基、GDF8、CHIR-99021、碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖和BSA组成；所述GDF8的浓度为80ng/mL～120ng/mL、所述CHIR-99021的浓度为0或2～4μmol/L、所述碳酸氢钠的浓度为2g/L～4g/L、所述谷氨酰胺的浓度为1mmol/L～3mmol/L、所述葡萄糖的浓度为15mmol/L～25mmol/L、所述BSA的浓度为1％～3％。3.一种诱导iPS细胞向内胚层细胞分化的方法，其特征在于，以权利要求2所述的培养基诱导iPS细胞向内胚层细胞分化；诱导3天，第1天所述培养基中CHIR-99021的浓度为2μmol/L～4μmol/L；第2～3天，所述培养基中GDF8的浓度为80ng/mL～120ng/mL。4.FGF7和/或抗坏血酸在制备促进内胚层细胞向原肠管分化的制剂中的应用。5.一种培养基，其特征在于，由MCDB131培养基、FGF7、抗坏血酸、碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖和BSA组成；所述FGF7的浓度为45ng/mL～55ng/mL；所述抗坏血酸的浓度为0.2mmol/L～0.3mmol/L；所述碳酸氢钠的浓度为2g/L～4g/L、所述谷氨酰胺的浓度为1mmol/L～3mmol/L、所述葡萄糖的浓度为15mmol/L～25mmol/L、所述BSA的质量分数为1％～3％。6.一种诱导内胚层细胞向原肠管分化的方法，其特征在于，以权利要求5所述的培养基诱导内胚层细胞向原肠管分化；所述诱导的时间为2d～3d。7.FGF7、SANT-1、RA、LDN193189、TPB、ITS-X、抗坏血酸中至少一种在制备诱导原肠管向后前肠分化的制剂中的应用或在制备诱导后前肠向胰腺祖细胞分化的制剂中的应用。8.一种培养基，其特征在于，由MCDB131培养基、FGF7、抗坏血酸、SANT-1、RA、ITS-X、LDN193189、TPB、碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖和BSA组成；所述FGF7的浓度为45ng/mL～55ng/mL；所述抗坏血酸的浓度为0.2mmol/L～0.3mmol/L；所述SANT-1的浓度为0.2mmol/L～0.3mmol/L；所述RA的浓度为0.8μmol/L～1.2μmol/L；所述ITS-X的浓度为1mmol/L～4mmol/L；所述LDN193189的浓度为80nmol/L～120nmol/L；所述TPB的浓度为180nmol/L～220nmol/L；所述碳酸氢钠的浓度为2g/L～4g/L、所述谷氨酰胺的浓度为1mmol/L～3mmol/L、所述葡萄糖的浓度为15mmol/L～25mmol/L、所述BSA的质量分数为1％～3％。9.一种诱导原肠管向后前肠分化的方法，其特征在于，以权利要求8所述的培养基诱导
原肠管向后前肠分化；所述诱导的时间为2d～3d。10.一种培养基，其特征在于，由MCDB131培养基、FGF7、抗坏血酸、SANT-1、RA、ITS-X、LDN193189、TPB、碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖和BSA组成；所述FGF7的浓度为1ng/mL～3ng/mL；所述抗坏血酸的浓度为0.2mmol/L～0.3mmol/L；所述SANT-1的浓度为0.2mmol/L～0.3mmol/L；所述RA的浓度为0.08μmol/L～0.12μmol/L；所述ITS-X的浓度为1mmol/L～4mmol/L；所述LDN193189的浓度为180nmol/L～220nmol/L；所述TPB的浓度为80nmol/L～120nmol/L；所述碳酸氢钠的浓度为2g/L～4g/L、所述谷氨酰胺的浓度为1mmol/L～3mmol/L、所述葡萄糖的浓度为15mmol/L～25mmol/L、所述BSA的使用浓度为1％～3％。11.一种诱导后前肠向胰腺祖细胞分化的方法，其特征在于，以权利要求10所述的培养基诱导原肠管向后前肠分化；所述诱导的时间为3d～5d。12.ITS-X、SAN-T、RA、T3、LDN193189、ALK5抑制剂II、硫酸锌、肝素钠中至少一种在制备促进胰腺祖细胞向内分泌前体细胞分化的制剂中的应用。13.一种培养基，其特征在于，由MCDB131培养基、ITS-X、SAN-T、RA、T3、LDN193189、ALK5抑制剂II、硫酸锌、肝素钠、碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖和BSA组成；所述ITS-X的浓度为1.5mmol/L～2.5mmol/L；所述SAN-T的浓度为0.2μmol/L～0.3μmol/L；所述RA的浓度为0.04μmol/L～0.06μmol/L；所述T3的浓度为0.8μmol/L～1.2μmol/L；所述LDN193189的浓度为80nmol/L～120nmol/L；所述ALK5抑制剂II的浓度为8μmol/L～12μmol/L；所述硫酸锌的浓度为8μmol/L～12μmol/L；所述肝素钠的浓度为8μg/mL～12μg/mL；所述碳酸氢钠的浓度为2g/L～4g/L、所述谷氨酰胺的浓度为1mmol/L～3mmol/L、所述葡萄糖的浓度为15mmol/L～25mmol/L、所述BSA的浓度为1％～3％。14.一种诱导胰腺祖细胞向内分泌前体细胞分化的方法，其特征在于，以权利要求13所述的培养基诱导胰腺祖细胞向内分泌前体细胞分化；所述诱导的时间为3d～5d。15.LDN193189、γ-分泌酶抑制剂、ITS-X、T3、ALK5抑制剂II、硫酸锌、肝素钠中至少一种在制备促进分泌前体细胞向幼稚胰岛细胞分化的制剂中的应用。16.一种培养基，其特征在于，由基础培养基、γ-分泌酶抑制剂、LDN193189、ITS-X、T3、ALK5抑制剂II、硫酸锌、肝素钠、碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖和BSA组成；所述LDN193189的浓度为80nmol/L～120nmol/L、
所述γ-分泌酶抑制剂的浓度为0或80nmol/L～120nmol/L、所述ITS-X的浓度为1.8mmol/L～2.2mmol/L、所述T3的浓度为0.8μmol/L～1.2μmol/L、所述ALK5抑制剂II的浓度为8μmol/L～12μmol/L、所述硫酸锌的浓度为8μmol/L～12μmol/L、所述肝素钠的浓度为8μg/mL～12μg/mL；所述碳酸氢钠的浓度为1g/L～4g/L、所述谷氨酰胺的浓度为1mmol/L～3mmol/L、所述葡萄糖的浓度为15...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴理达，顾雨春，张会远，安翠平，
申请(专利权)人：北京呈诺医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：