一种新的ips细胞的诱导方法技术

本发明专利技术公开了一种新的ips细胞的诱导方法。本发明专利技术提供了诱导因子Oct3/4、Klf4、Sox2、P53、L‑Myc、Lin28、RARg和Lrh‑1在诱导离体哺乳动物体细胞产生iPS多能干细胞中的应用。本发明专利技术建立iPS细胞的方法，在无插入的基础上建立了无外源血清，无滋养层细胞，无动物源的人iPS干细胞的诱导方法；该方法缩短了iPS多能干细胞的重编程时间，提高了克隆产生效率，得到的iPS细胞干性更好。

【技术实现步骤摘要】
一种新的ips细胞的诱导方法
本专利技术涉及细胞工程领域，尤其是涉及一种新的ips细胞的诱导方法。
技术介绍
2006年，山中伸弥的团队专利技术了一种由OCT4,SOX2,KLF4和c-Myc四种转录因子构成的“鸡尾酒”法，能够成功将终端分化的皮肤成纤维细胞重编程成为具有分化多能性的干细胞，这种干细胞被称为诱导多能干细胞(inducedpluripotentcells)。这些干细胞具有和胚胎干细胞(embryonicstemcells)类似的分化潜能，能够形成人体发育最基本的三个胚层，并最终形成多种成体细胞。这一突破性的专利技术突破了在医学上使用人胚胎干细胞的伦理限制，而且利用这一技术可以获得患者特异性的iPSC，可以解决细胞移植治疗中的免疫排斥问题，大大拓展了干细胞技术在临床医学上的应用潜力。尽管近年来iPS技术不断取得发展，各种改良技术时有出现。然而重编程效率低下和iPS干细胞的干性低一直都是科学家们头疼的问题。解析体细胞重编程过程中的分子调控机制，开发出高效安全的iPS技术成为了近年来干细胞领域研究人员的热点。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种用重编程体外诱导产生iPS多能干细胞的方法。本专利技术提供的方法，包括如下步骤：(1)在离体人或哺乳动物体细胞中过表达或表达全部诱导因子Oct3/4、Klf4、Sox2、P53、L-Myc、Lin28、RARg、Lrh-1和EBNA1，得到转基因细胞；(2)诱导培养所述转基因细胞，即得到iPS多能干细胞。上述方法中，所述步骤(1)的方法为如下：将诱导因子导入离体人或哺乳动物体细胞中，得到转基因细胞，所述诱导因子为Oct3/4基因、Klf4基因、Sox2基因、P53基因、L-Myc基因、Lin28基因、RARg基因和Lrh-1基因和EBNA1；和/或，在步骤(2)后还包括如下步骤：将所述iPS多能干细胞进行扩增培养。上述方法中，所述Oct3/4基因、所述Klf4基因、所述Sox2基因、所述P53基因、所述L-Myc基因、所述Lin28基因、所述RARg基因和所述Lrh-1基因通过重组载体导入试试离体哺乳动物体细胞中。上述方法中，所述Oct3/4基因、所述Klf4基因、所述Sox2基因、所述P53基因、所述L-Myc基因和所述Lin28基因通过表达其的一个重组载体导入所述人或哺乳动物体细胞中；所述一个重组载体为将片段A插入pCXWB载体中得到的载体，表达Oct3/4、Klf4、Sox2、P53、L-Myc和Lin28基因；所述片段A的核苷酸序列包括Oct3/4基因序列、Klf4基因序列、Sox2基因序列、P53基因序列、IRES序列、L-Myc基因序列和Lin28基因序列；所述RARg和所述Lrh-1基因通过表达其的另一个重组载体导入所述人或哺乳动物体细胞中；所述另一个重组载体为将片段B插入pCXWB载体的中得到的载体，表达RARg和Lrh-1基因；所述片段B的核苷酸序列包括RARg基因序列和Lrh-1基因序列。上述方法中，所述片段A的核苷酸序列依次由Oct3/4基因序列、T2A核苷酸序列、Klf4基因序列、P2A核苷酸序列、Sox2基因序列、所述T2A核苷酸序列、P53基因序列、IRES序列(IRES序列常用于多顺反子基因表达。在目的基因之后插入IRES序列，后面是选择标记基因，这样转录出来的mRNA就可以同时表达两种蛋白)、L-Myc基因序列、E2A核苷酸序列和Lin28基因序列组成，且各个序列均按照5'-3端的顺序依次连接；或，所述片段B的核苷酸序列依次由EF1α启动子序列、RARg基因序列、T2A核苷酸序列、Lrh-1基因序列和Kozak片段(是位于真核生物mRNA5’端帽子结构后面的一段核酸序列，通常是ACCACCATGG，它可以与翻译起始因子结合而介导含有5’帽子结构的mRNA翻译起始)核苷酸序列组成，且各个序列均按照5'-3端的顺序依次连接(序列表的序列按照5‘-3’列出的)；所述Oct3/4基因序列为序列1；所述T2A核苷酸序列为序列9；所述Klf4基因序列为序列2；所述P2A核苷酸序列为序列10；所述Sox2基因序列为序列3；所述P53基因序列为序列6；所述IRES序列为序列12；所述L-Myc基因序列为序列4；所述E2A核苷酸序列为序列11；所述Lin28基因序列为序列5；所述EF1α启动子序列为序列13；所述RARg基因序列为序列7；所述Lrh-1基因序列为序列8；所述Kozak片段核苷酸序列为序列14。上述方法中，所述诱导培养的时间为15-30天；和/或；所述诱导培养的时间为25天。和/或；所述体细胞为成纤维细胞或血液细胞；或所述哺乳动物为大鼠、小鼠、猴、狗、猫、牛、兔、马或猪。由上述的方法制备的iPS多能干细胞也是本专利技术保护的范围。本专利技术另一个目的是提供一种用于诱导使离体哺乳动物体细胞产生iPS多能干细胞的试剂盒。本专利技术提供的试剂盒，为如下1)-3)中任一种：1)诱导因子Oct3/4、Klf4、Sox2、P53、L-Myc、Lin28、RARg和Lrh-1；2)表达诱导因子Oct3/4、Klf4、Sox2、P53、L-Myc、Lin28、RARg和Lrh-1基因的重组载体；3)表达诱导因子Oct3/4、Klf4、Sox2、P53、L-Myc、Lin28、RARg和Lrh-1基因的慢病毒或重组哺乳动物体细胞。上述的试剂盒在诱导使离体哺乳动物体细胞产生iPS多能干细胞中的应用也是本专利技术保护的范围；或上述的试剂盒在用重编程制备iPS多能干细胞中的应用也是本专利技术保护的范围。上述诱导因子Oct3/4、Klf4、Sox2、P53、L-Myc、Lin28、RARg和Lrh-1在诱导离体哺乳动物体细胞产生iPS多能干细胞中的应用也是本专利技术保护的范围。上述诱导因子为DNA形式、mRNA形式或蛋白质形式；本专利技术提供一种建立iPS细胞的方法，在无插入的基础上建立了无外源血清，无滋养层细胞，无动物源的人iPS干细胞的诱导方法；该方法缩短了iPS多能干细胞的重编程时间，提高了克隆产生效率，得到的iPS细胞干性更好；该方法采用的诱导培养因子中使用EBNA1(EB病毒核抗原)，该因子能够增加episomal载体增值进而调节重编程因子的表达量，确保每一个细胞周期，这些因子以一定表达分子数量进入细胞，从而达到精确调控因子瞬时表达得目的，从而准确利用癌化和重编程之间的调控的窗口期，使细胞顺利完成重编程而不是转向癌细胞生成。附图说明图1为iPS细胞的形态鉴定结果。图2为iPS细胞碱性磷酸酶染色结果。图3为iPS细胞免疫荧光结果。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、重编程因子载体的制备重编程中使用了8个重编程因子：Oct3/4,Klf4,Sox2,P53,L-Myc,Lin28,RARg,Lrh-1，表达载体为episomal载体。表达载体为episomal载体，具体采用pCXWB，购买自addgene。重编程因子载体A为将片段A插入pCXWB载体ECoRⅠ酶切位点间得到的载体，表达Oct3/4,Klf4,Sox2,P53,L-Myc,Lin28基因；片段A的核苷酸本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用重编程体外诱导产生iPS多能干细胞的方法，包括如下步骤：(1)在离体人或哺乳动物体细胞中过表达或表达全部诱导因子Oct3/4、Klf4、Sox2、P53、L‑Myc、Lin28、RARg、Lrh‑1和EBNA1，得到转基因细胞；(2)诱导培养所述转基因细胞，即得到iPS多能干细胞。

【技术特征摘要】
1.一种用重编程体外诱导产生iPS多能干细胞的方法，包括如下步骤：(1)在离体人或哺乳动物体细胞中过表达或表达全部诱导因子Oct3/4、Klf4、Sox2、P53、L-Myc、Lin28、RARg、Lrh-1和EBNA1，得到转基因细胞；(2)诱导培养所述转基因细胞，即得到iPS多能干细胞。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)的方法为如下：将诱导因子导入离体人或哺乳动物体细胞中，得到转基因细胞，所述诱导因子为Oct3/4基因、Klf4基因、Sox2基因、P53基因、L-Myc基因、Lin28基因、RARg基因和Lrh-1基因和EBNA1；和/或，在步骤(2)后还包括如下步骤：将所述iPS多能干细胞进行扩增培养。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述Oct3/4基因、所述Klf4基因、所述Sox2基因、所述P53基因、所述L-Myc基因、所述Lin28基因、所述RARg基因和所述Lrh-1基因通过重组载体导入试试离体哺乳动物体细胞中。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述Oct3/4基因、所述Klf4基因、所述Sox2基因、所述P53基因、所述L-Myc基因和所述Lin28基因通过表达其的一个重组载体导入所述人或哺乳动物体细胞中；所述一个重组载体为将片段A插入pCXWB载体中得到的载体，表达Oct3/4、Klf4、Sox2、P53、L-Myc和Lin28基因；所述片段A的核苷酸序列包括Oct3/4基因序列、Klf4基因序列、Sox2基因序列、P53基因序列、IRES序列、L-Myc基因序列和Lin28基因序列；所述RARg和所述Lrh-1基因通过表达其的另一个重组载体导入所述人或哺乳动物体细胞中；所述另一个重组载体为将片段B插入pCXWB载体的中得到的载体，表达RARg和Lrh-1基因；所述片段B的核苷酸序列包括RARg基因序列和Lrh-1基因序列。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述片段A的核苷酸序列依次由Oct3/4基因序列、T2A核苷酸序列、Klf4基因序列、P2A核苷酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：顾雨春，吴理达，
申请(专利权)人：北京呈诺医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11