CD34制造技术

本发明专利技术涉及细胞培养技术领域，特别涉及一种诱导多能干细胞分化为CD34

【技术实现步骤摘要】
CD34
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细胞分化培养基、方法及应用


[0001]本专利技术涉及细胞培养
，特别涉及CD34
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细胞分化培养基、方法及应用。

技术介绍

[0002]CD34是一类跨膜磷酸糖蛋白，特异性地表达于造血前体细胞、血管内皮细胞、生血内皮细胞和各种间质前体细胞；且是造血干/祖细胞的主要标志物。由于CD34
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细胞广泛存在于多种组织，且部分CD34
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细胞具有分化的潜能；因此，CD34
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细胞或由其分化获得的细胞可以应用于药物筛选、再生医学的研究或通过细胞移植来治疗相关的疾病。多能干细胞(Pluripotent Stem Cells，PSC)是一类具有自我更新和分化潜能的细胞，包括胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells，ESC)、诱导多能干细胞(induced Pluripotent Stem Cells，iPSC)及扩展多能干细胞(Extended Pluripotent Stem Cells，EPSC)和全能干细胞(Totipotent Stem Cells，TPSC)等；其可以诱导分化为CD34
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细胞。但目前的分化方法存在很多的不足，主要包括诱导效率低下、分化周期长、分化流程复杂及分化培养基中含有动物源成分等，这些不足严重地限制了CD34
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细胞的临床研究和应用。
[0003]目前有较多的文献报道CD34
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细胞分化方法，但这些方法存在很多的不足，主要包括诱导效率低下、分化周期长、分化流程复杂及分化培养基中含有动物源成分等，这些不足严重地限制了CD34
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细胞的临床研究和应用。
[0004]有研究公开了一种多能干细胞分化成造血干细胞的培养基及方法，该专利技术通过适当使用一种用新型的嘧啶吲哚化合物配合三种特定成分和浓度的诱导多能干细胞分化成造血干细胞的培养基，提高了多能干细胞向造血干细胞分化的效率，但是该专利技术中每个阶段使用的培养基成分都较复杂，还需引入新型化合物，操作复杂，成本较高。
[0005]还有研究公开了一种用于诱导造血细胞分化的方法和组合物，使用到了BMP途径激活剂、bFGF、WNT途径激活剂、ROCK抑制剂，但是其使用的基础培养基种类较多，各个阶段添加的成分都比较复杂，诱导时间较长，不易操作，不利于规模化和产业化。

技术实现思路

[0006]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种诱导多能干细胞分化为CD34
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细胞的培养基组合、试剂盒、方法及应用。本专利技术的分化体系的培养基成分简单，不用形成拟胚体，无须引入新型化合物，操作简单，成本低、时间短，有利于规模化和产业化。
[0007]本专利技术的上述目的通过以下技术方案得以实现：
[0008]本专利技术的第一方面提供了培养基组合，特别是诱导多能干细胞分化为CD34
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细胞的培养基组合，所述培养基组合包括第一培养基、第二培养基、第三培养基和第四培养基；
[0009]所述第一培养基包括第一基础培养基和ROCK抑制剂；优选地，所述ROCK抑制剂为Y
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27632；更优选地，所述Y
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27632的浓度为10μM；
[0010]需要说明的是，所述ROCK抑制剂还可以是Thiazovivin、Fasudil(HA
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1077,AT
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877)、GSK429286A、RKI
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1447、H
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1152dihydrochloride、Emetine hydrochloride、
GSK269962A、Netarsudil、Azaindole 1、Y
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39983、ZINC00881524、Belumosudil、Ripasudil、Hydroxyfasudil和/或AT13148；
[0011]所述第二培养基包括第二基础培养基和WNT通路激动剂；优选地，所述第二培养基不包括BMP通路激动剂；更优选地，所述第二培养基不包括BMP通路激动剂、VEGF通路激动剂和FGF通路激动剂；优选地，所述WNT通路激动剂包括GSK
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3抑制剂；更优选地，所述GSK
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3抑制剂为CHIR99021；更优选地，所述CHIR99021的浓度为6～12μM；最优选地，所述CHIR99021的浓度为9μM；
[0012]本申请专利技术人通过实验证实，在上述第二培养基中添加VEGF或bFGF并不能促进CD34
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细胞的生成，添加BMP4反而会抑制CD34
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细胞的生成，仅通过CHIR激活WNT信号即可实现CD34
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和CD34
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CD144
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生血内皮细胞高效诱导分化；
[0013]所述第三培养基包括所述第二基础培养基、VEGF通路激动剂和FGF通路激动剂；优选地，所述VEGF通路激动剂为VEGF，所述FGF通路激动剂为bFGF，更优选地，所述VEGF的浓度为10～80ng/mL，所述bFGF的浓度为10～80ng/mL；
[0014]本申请专利技术人通过实验证实，在所述第二基础培养基的基础上同时添加BMP4、VEGF会抑制KDR
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CD34
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CD144
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生血内皮细胞的分化潜能，加入bFGF后会逆转BMP4的抑制作用；而同时添加VEGF、bFGF则会显著提高KDR
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CD34
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CD144
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生血内皮细胞的分化潜能。可见，VEGF和bFGF可以协同促进中胚层细胞向KDR
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PDGFRα
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造血中胚层的分化以及造血中胚层向KDR
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CD34
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CD144
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生血内皮细胞的转换；
[0015]所述第四培养基包括所述第二基础培养基、VEGF通路激动剂、FGF通路激动剂、SCF/c
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kit通路激动剂、白细胞介素、TPO通路激动剂、Flt
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3L和/或BMP通路激动剂；优选地，所述VEGF通路激动剂为VEGF，所述FGF通路激动剂为bFGF，所述SCF/c
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kit通路激动剂为SCF，所述白细胞介素为IL
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3，所述TPO通路激动剂为TPO，所述BMP通路激动剂为BMP4；更优选地，所述VEGF、所述bFGF和所述SCF的浓度分别为10～80ng/mL，所述IL
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3的浓度为5～40ng/mL，所述TPO的浓度为10～60ng/mL，所述Flt
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3L的浓度为5～40ng/mL，所述BMP4的浓度为10～60ng/mL；最优选地，所述VEGF的浓度为20ng/mL，所述bFGF的浓度为20ng/m本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.培养基组合，其特征在于，所述培养基组合包括第一培养基、第二培养基、第三培养基和第四培养基；所述第一培养基包括第一基础培养基和ROCK抑制剂；优选地，所述ROCK抑制剂为Y
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27632；所述第二培养基包括第二基础培养基和WNT通路激动剂；优选地，所述第二培养基不包括BMP通路激动剂；更优选地，所述第二培养基不包括BMP通路激动剂、VEGF通路激动剂和FGF通路激动剂；优选地，所述WNT通路激动剂包括GSK
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3抑制剂；更优选地，所述GSK
‑
3抑制剂为CHIR99021；更优选地，所述CHIR99021的浓度为6～12μM；最优选地，所述CHIR99021的浓度为9μM；所述第三培养基包括所述第二基础培养基、VEGF通路激动剂和FGF通路激动剂；优选地，所述VEGF通路激动剂为VEGF，所述FGF通路激动剂为bFGF，更优选地，所述VEGF的浓度为10～80ng/mL，所述bFGF的浓度为10～80ng/mL；所述第四培养基包括所述第二基础培养基、VEGF通路激动剂、FGF通路激动剂、SCF/c
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kit通路激动剂、白细胞介素、TPO通路激动剂、Flt
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3L和/或BMP通路激动剂；优选地，所述VEGF通路激动剂为VEGF，所述FGF通路激动剂为bFGF，所述SCF/c
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kit通路激动剂为SCF，所述白细胞介素为IL
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3，所述TPO通路激动剂为TPO，所述BMP通路激动剂为BMP4；更优选地，所述VEGF、所述bFGF和所述SCF的浓度分别为10～80ng/mL，所述IL
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3的浓度为5～40ng/mL，所述TPO的浓度为10～60ng/mL，所述Flt
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3L的浓度为5～40ng/mL，所述BMP4的浓度为10～60ng/mL；最优选地，所述VEGF的浓度为20ng/mL，所述bFGF的浓度为20ng/mL，所述SCF的浓度为50ng/mL，所述IL
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3的浓度为10ng/mL，所述TPO的浓度为30ng/mL，所述Flt
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3L的浓度为10ng/mL，所述BMP4的浓度为10ng/mL；优选地，所述第一培养基中的所述第一基础培养基包括E8培养基；更优选地，所述第一培养基中的所述第一基础培养基为E8培养基；优选地，所述第二培养基、第三培养基和第四培养基中的所述第二基础培养基包括APEL培养基；更优选地，所述第二培养基、第三培养基和第四培养基中的所述第二基础培养基为APEL培养基。2.试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包含配制如权利要求1所述的培养基组合，以及所需要的其他试剂。3.诱导多能干细胞分化为CD34
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细胞的方法，所述方法包括如下步骤：步骤(1)：提供诱导多能干细胞并在如权利要求1所述的培养基组合中的第一培养基中进行单层分化培养，获得单层细胞；步骤(2)：将步骤(1)中所述单层细胞接种于如权利要求1所述的培养基组合中的第二培养基，培养，获得中胚层细胞；步骤(3)：将步骤(2)中所述中胚层细胞接种于如权利要求1所述的培养基组合中的第三培养基，培养，获得造血中胚层细胞；优选地，所述造血中胚层细胞为KDR
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PDGFRα
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造血中胚层细胞；优选地，所述造血中胚层细胞经过...

【专利技术属性】
技术研发人员：杜如龙，顾雨春，武雪宁，于蕾，黄雯静，吴理达，
申请(专利权)人：北京呈诺医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：