一种离体干细胞扩大培养方法和应用技术

本发明专利技术涉及干细胞培养技术领域，用于解决现有的体外培养条件诱导应激，导致细胞快速增殖，代谢活性增加，失去了定义原代造血干细胞的原始特征，而且，通过使用生长因子/细胞因子/化学物质的混合物，干细胞扩增只取得了有限的成功，此外，造血干细胞体外培养的高成本是产业化和临床应用的另一个障碍的问题，具体涉及一种离体干细胞扩大培养方法和应用；该方法中通过化合物组合与单用VPA对人造血干细胞体外增殖的促进作用，我们的培养体系具有很强的诱导造血干细胞扩增的能力，我们的化合物组合与芳香族受体拮抗剂SR1联用，能大幅度提扩增效率，将有望真正改善临床上脐带血移植的结果，这对临床治疗是非常有价值的发现。这对临床治疗是非常有价值的发现。这对临床治疗是非常有价值的发现。

【技术实现步骤摘要】
一种离体干细胞扩大培养方法和应用


[0001]本专利技术涉及干细胞培养
，具体涉及一种离体干细胞扩大培养方法和应用，更具体涉及一种对脐带血造血干细胞CD34+体外高效扩增的方法与应用。

技术介绍

[0002]造血干细胞能够自愈并分化为所有类型的血细胞，包括红细胞、髓系和淋巴系。造血干细胞在临床上被用作多种造血系统恶性肿瘤的细胞治疗药物，包括白血病。从脐带血中获得的造血干细胞的体外扩增因其在多种血液病治疗中的应用而成为一个重要的研究领域。该过程有望模拟由基质细胞及其产生的材料组成的正常骨髓生态位。因此，几乎所有的扩展方案都包含早期和晚期作用的细胞因子，以促进造血细胞的生长。目前用于移植的造血干细胞有三种来源，分别是脐带血、外周血和骨髓。由于这些细胞用于临床移植的可用性有限，为了获得足够数量的可移植造血干细胞，人们在过去进行了许多体外扩增的尝试。绝大多数体外扩张造血干细胞的策略都集中在通过内在因子(如转录因子和信号分子)或环境因子(如细胞因子、趋化因子、基质细胞和粘附分子)调节造血干细胞的更新和生存。通过与骨髓间充质间质细胞、永生化间质细胞共培养或过度表达自我更新基因如HOXB4和Sall4b，可以实现合理的干细胞扩增。
[0003]然而，这些方法涉及到对基质环境的操纵或对造血干细胞基因组的干扰，冒着意想不到的不利影响的风险。因此，开发一种简单有效的HSC扩张途径势在必行。在过去的二十年里，各种细胞因子、小分子和化学物质被用于体外扩大造血干细胞，包括血小板生成素(TPO)、Fms相关酪氨酸激酶3配体(Flt
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3L)粒细胞集落刺激因子(G
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CSF)、白细胞介素(IL)
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3、
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6、
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11、干细胞因子(SCF)、血管生成素(Ang)
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1、StemRegenin 1(SR1)和四乙烯五胺(TEPA)。此外，原代间充质干细胞等各种基质细胞可以提高扩增效率。
[0004]目前，已经开发出多种方法和策略，从脐带血中体外扩大培养获得的有限数量的造血干细胞。在体外培养中，不同的细胞因子混合物与小分子或化合物的组合可导致造血干细胞细胞数目不同程度的扩张。重要的是，体外培养条件诱导应激，导致细胞快速增殖，代谢活性增加，失去了定义原代造血干细胞的原始特征，而且，通过使用生长因子/细胞因子/化学物质的混合物，干细胞扩增只取得了有限的成功，此外，造血干细胞体外培养的高成本是产业化和临床应用的另一个障碍。因此，进一步优化效率，降低成本仍有很大的需求，需要开发一种方法，使大量具有与初级原始造血干细胞相似特征的功能性造血干细胞得到扩展。

技术实现思路

[0005]为了克服上述的技术问题，本专利技术的目的在于提供一种离体干细胞扩大培养方法和应用，通过依次进行Buffer和培养基的准备、从脐带血分离单核细胞、从单核细胞中磁珠分选CD34+细胞、CD34+细胞培养及化合物干预以及抗体染色用于流式细胞术分析五个步骤，实现将离体干细胞扩大培养，解决了现有的体外培养条件诱导应激，导致细胞快速增
殖，代谢活性增加，失去了定义原代造血干细胞的原始特征，而且，通过使用生长因子/细胞因子/化学物质的混合物，干细胞扩增只取得了有限的成功，此外，造血干细胞体外培养的高成本是产业化和临床应用的另一个障碍的问题。
[0006]本专利技术的目的可以通过以下技术方案实现：
[0007]一种离体干细胞扩大培养方法，包括以下步骤：
[0008]步骤一：Buffer和培养基的准备；
[0009]步骤二：从脐带血分离单核细胞；
[0010]步骤三：从单核细胞中磁珠分选CD34+细胞；
[0011]步骤四：人CD34+细胞培养及化合物干预；
[0012]步骤五：抗体染色用于流式细胞术分析。
[0013]作为本专利技术进一步的方案：步骤一中所述的Buffer和培养基的准备的具体过程如下：
[0014]在从脐带血分离CD34+细胞的24小时之前，将2mL0.5M的乙二胺四乙酸(EDTA)和33mL质量分数为7.5％的牛血清白蛋白(BSA)加入到465mL缓冲生理盐水(1xPBS)中，制备分离缓冲液，混合后并保持分离缓冲液在4℃下过夜。
[0015]作为本专利技术进一步的方案：步骤二中所述的从脐带血分离单核细胞的具体过程如下：
[0016]S21：将脐带血放入一个75cm2的培养瓶中，在室温条件下，用等质量的PBS稀释并混合脐带血，得到稀释脐带血；
[0017]S22：确定处理整个脐带血所需的管数(一个50mL的离心管可用于处理35mL稀释脐带血)，在每个试管中加入15mL浓度梯度介质，并将稀释脐带血涂抹在浓度梯度介质的顶部，形成两层；
[0018]S23：在离心力为400xg的条件下低速加减速离心30min，离心后，单核细胞位于血浆和密度梯度介质层之间的白色层(淡色层)；
[0019]S24：抽吸2/3的血浆，不影响淡黄色涂层，将淡黄色涂层转移到一个新的50mL试管中，从同一个脐带血收集所有的单核细胞，收集到50mL的试管中，直到达到25mL，如果收集到的单核细胞的体积超过25mL，使用新的试管；
[0020]S25：将25mL的冷PBS加入含有25mL单核细胞的试管中，混合均匀，在温度为4℃，离心力为400xg的条件下离心10min；
[0021]S26：吸出上清液，将细胞颗粒重新悬浮在50mL冷PBS中；
[0022]S27：取细胞悬液20μL计数，具体如下：用自动细胞计数器计数吖啶橙/碘化丙啶染色的细胞数量，计算单核细胞的总数；
[0023]S28：在温度为4℃，离心力为400xg的条件下离心15min。
[0024]作为本专利技术进一步的方案：步骤三中所述的从单核细胞中磁珠分选CD34+细胞的具体过程如下：
[0025]S31：准备CD34+抗体偶联磁珠溶液，从单核细胞分离CD34+细胞，具体如下：
[0026]将300μL的分离缓冲液与100μL的人FcR人IgG(阻断试剂)和100μL的CD34磁珠混合，得到CD34+抗体偶联磁珠溶液，从每108个单核细胞中分离CD34+细胞，为了从单核细胞中分离更多数量的CD34+细胞，相应地扩大试剂的规模；
[0027]S32：将步骤S28中离心的试管中吸取上清液，将微球重悬于CD34+抗体偶联磁珠溶液中(每108个细胞使用500μL溶液)；
[0028]S33：混合后在温度为4℃的条件下孵育30min；
[0029]S34：向含有细胞混合物的试管中加入冷细胞分离缓冲液，直到管完全充满，之后在温度为4℃，离心力为400xg的条件下离心15min；
[0030]S35：抽吸上清液，在冷细胞分离缓冲液中重悬细胞球(2mL/108细胞)，将2mL细胞悬液混合物转移到15mL的试管中。
[0031]S36：将3组15mL的试管装入温度为4℃的预冷本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种离体干细胞扩大培养方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：Buffer和培养基的准备；步骤二：从脐带血分离单核细胞；步骤三：从单核细胞中磁珠分选CD34+细胞；步骤四：人CD34+细胞培养及化合物干预；步骤五：抗体染色用于流式细胞术分析。2.根据权利要求1所述的一种离体干细胞扩大培养方法，其特征在于，步骤一中所述的Buffer和培养基的准备的具体过程如下：在从脐带血分离CD34+细胞的24小时之前，将2mL0.5M的乙二胺四乙酸和33mL质量分数为7.5％的牛血清白蛋白加入到465mL缓冲生理盐水中，制备分离缓冲液，混合后并保持分离缓冲液在4℃下过夜。3.根据权利要求1所述的一种离体干细胞扩大培养方法，其特征在于，步骤二中所述的从脐带血分离单核细胞的具体过程如下：S21：将脐带血放入一个75cm2的培养瓶中，在室温条件下，用等质量的PBS稀释并混合脐带血，得到稀释脐带血；S22：确定处理整个脐带血所需的管数，在每个试管中加入15mL浓度梯度介质，并将稀释脐带血涂抹在浓度梯度介质的顶部，形成两层；S23：在离心力为400xg的条件下离心30min，离心后，单核细胞位于血浆和密度梯度介质层之间的白色层；S24：抽吸2/3的血浆，不影响淡黄色涂层，将淡黄色涂层转移到一个新的50mL试管中，从同一个脐带血收集所有的单核细胞，收集到50mL的试管中，直到达到25mL；S25：将25mL的冷PBS加入含有25mL单核细胞的试管中，混合均匀，在温度为4℃，离心力为400xg的条件下离心10min；S26：吸出上清液，将细胞颗粒重新悬浮在50mL冷PBS中；S27：取细胞悬液20μL计数，具体如下：用自动细胞计数器计数吖啶橙/碘化丙啶染色的细胞数量，计算单核细胞的总数；S28：在温度为4℃，离心力为400xg的条件下离心15min。4.根据权利要求1所述的一种离体干细胞扩大培养方法，其特征在于，步骤三中所述的从单核细胞中磁珠分选CD34+细胞的具体过程如下：S31：准备CD34+抗体偶联磁珠溶液，从单核细胞分离CD34+细胞，具体如下：将300μL的分离缓冲液与100μL的人FcR人IgG和100μL的CD34磁珠混合，得到CD34+抗体偶联磁珠溶液，从每108个单核细胞中分离CD34+细胞；S32：将步骤S28中离心的试管中吸取上清液，将微球重悬于CD34+抗体偶联磁珠溶液中；S33：混合后在温度为4℃的条件下孵育30min；S34：向含有细胞混合物的试管中加入冷细胞分离缓冲液，直到管完全充满，之后在温度为4℃，离心力为400xg的条件下离心15min；S35：抽吸上清液，在冷细胞分离缓冲液中重悬细胞球，将2mL细胞悬液混合物转移到15mL的试管中；
S36：将3组15mL的试管装入温度为4℃的预冷的细胞分离器中，...

【专利技术属性】
技术研发人员：傅小聪，袁曾津，
申请(专利权)人：上海派思维新生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：