一种异体间接干细胞追踪的方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种异体间接干细胞追踪的方法和应用，具体包括如下步骤：干细胞注入SD大鼠中，输入肺组织，取出肺各叶组织消化成单个细胞悬液，再进行破膜和抗体染色，上机检测，根据panel进行抗核抗原抗体和细胞骨架蛋白的检测，读取相应的表达强度和平均荧光强度结果，确认干细胞的分布和归巢数目，通过直接五标记法进行干细胞的直接检测，1、能够直接性检测干细胞在归巢靶器官的检测，更加可靠性的反映出追踪干细胞的实质性；2、对小微量的干细胞也可也识别和检测出，提供了灵敏度；3、该发明专利技术有力的催进了干细胞的治疗效果研究和相应的体内靶器官的分布甚至是示踪提供了有效的解决方案。决方案。决方案。

【技术实现步骤摘要】
一种异体间接干细胞追踪的方法和应用


[0001]本专利技术涉及干细胞追踪
，具体涉及一种异体间接干细胞追踪的方法和应用。

技术介绍

[0002]干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。干细胞技术最显著的作用就是能再造一种全新的、正常的甚至更年轻的细胞、组织或器官，用以治疗多种传统方法难以治愈的疾病。目前应用最成熟的是利用造血干细胞移植进行造血和免疫系统的重建，同时随着干细胞基础技术的快速发展，其它干细胞应用如间充质干细胞、心肌干细胞、诱导性多能干细胞等细胞替代治疗的相关临床研究也在陆续开展，在部分领域已经取得了突破性进展。当前干细胞研究主要存在的问题是追踪和归巢检测干细胞的分布以及对病灶的修复能力评估。随着干细胞基本原理和相关技术的成熟和更新，以及监管政策的不断转暖，各国已纷纷加快干细胞的临床研究，列入国家科技的战略必争领域。国际上干细胞相关研究正在如火如荼的开展。围绕干细胞的研究除了细胞治疗、组织器官移植修复、基因治疗之外，正朝着药物研发、毒性评估工具、发育生物学模型等领域转变。干细胞研究中的追踪是干细胞治疗的主要辅助手段和机制甚至药效评估的主要依据。无论是体外检测还是体内示踪，对于当前干细胞治疗研究而言都缺乏最有效的手段和方法直接说明干细胞的治疗效果的同时定位干细胞在病灶的含量和分布水平。
[0003]本专利技术基于提高干细胞的追踪灵敏度和直接五标记法进行干细胞的直接检测，无需体外转染和外加任何的标志物以及荧光等信号，而且大大提高了追踪干细胞的灵敏度。/>
技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种异体间接干细胞追踪的方法和应用。
[0005]本专利技术要解决的技术问题：1、需要借助于体外对干细胞进行转染相关荧光蛋白，该转染对干细胞的潜在发育和分化潜能会造成一定的影响。
[0006]2、不同的干细胞荧光标志对精准定位干细胞和归巢靶器官位点都不特别精确，对于明确定位干细胞还是无法很好的满足。
[0007]3、荧光标志的干细胞追踪方法在灵敏度存在一定的差异，基于不同的方法在灵敏度上都有一定的差异化。
[0008]本专利技术的目的可以通过以下技术方案实现：
[0009]一种异体间接干细胞追踪的方法，包括如下步骤：
[0010]步骤S1：用blank，0.01M，0.05M,0.1M，0.5M，1M，5M和10M浓度的干细胞进行human Fc blocker孵育后进行固定buffer的固定后进行破膜试剂的破膜，各孵育30分钟后并进行相应的离心清洗后再进行相应胞内抗体的染色，后上机检测，仪器进行setup后，每日QC完成，进行正式样本的检测；
[0011]步骤S1：将3只SD大鼠经过动物适应期后，使用干细胞进行输注，干细胞进入肺组
织后安乐死并解剖去完整肺组织，取出肺各叶组织消化成单个细胞悬液，再进行Fc blocker孵育后进行固定buffer的固定后进行破膜试剂的破膜，各孵育30分钟并进行相应的离心清洗后再进行相应胞内抗体的染色后，上机检测，根据panel进行抗核抗原抗体和细胞骨架蛋白的检测，读取相应的表达强度和平均荧光强度结果，确认干细胞的分布和归巢数目。
[0012]进一步，所述的肺各叶组织消化具体包括如下步骤：
[0013]步骤A1：肺组织消化；
[0014]步骤A2：胞外抗体染色；
[0015]步骤A3：固定和破膜；
[0016]步骤A4：胞内/核内染色；
[0017]步骤A5：仪器setup后上机检测。
[0018]进一步，所述的肺组织消化具体包括如下步骤：
[0019]步骤A11：将肺组织使用DPBS清洗一次，去除相应的粘连物并剪碎；
[0020]步骤A12：将已经剪碎的肺组织转移至消化酶中，放入GentleMACS Dissociators中并放置在37℃水浴锅中，消化30分钟；
[0021]步骤A13：消化结束后，加入DPBS混合均匀，用70μm滤膜过滤；
[0022]步骤A14：将过滤物用PBS清洗两次后，在转速为1500rpm的条件下，离心10分钟，去除上清液。
[0023]进一步，所述的胞外抗体染色具体包括如下步骤：
[0024]步骤A21：将细胞沉淀量加入用相应体积的1xDPBS重悬，吹匀，取1x106细胞加入流式管，离心5分钟，去上清液；
[0025]步骤A22:将100μL含有Live
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Dead的Staining buffer重悬细胞，每管加入5μL Fc block，4℃避光孵育5min，随后直接加入相应抗体，避光孵育30分钟；
[0026]步骤A23：在温度为4℃，离心力350xg的条件下，离心5分钟，去除上清，200μL Staining buffer重悬细胞，温度为4℃，离心力350xg的条件下，重复一次；
[0027]步骤A24：用100μL Fixation buffer重悬细胞，在温度为4℃的条件下，避光孵育20
‑
30分钟后，重复步骤A23。
[0028]进一步，所述的固定和破膜具体包括如下步骤：
[0029]步骤A31:增加100μL新配置的固定破膜buffer，在温度为4℃的条件下，避光孵育20
‑
30分钟。
[0030]步骤A32：重复步骤A23。
[0031]进一步，所述的胞内/核内染色具体包括如下步骤：
[0032]步骤A41：增加100μL破膜buffer并重悬细胞；
[0033]步骤A42：增加胞内染色抗体，在温度为4℃的条件下，避光孵育20
‑
30分钟；
[0034]步骤A43：重复步骤A23。
[0035]本专利技术的有益效果：本专利技术公开的一种异体间接干细胞追踪的方法和应用，1、能够直接性检测干细胞在归巢靶器官的检测，更加可靠性的反映出追踪干细胞的实质性；2、对小微量的干细胞也可也识别和检测出，提供了灵敏度；3、该专利技术有力的催进了干细胞的治疗效果研究和相应的体内靶器官的分布甚至是示踪提供了有效的解决方案。
block，4℃避光孵育5min，随后直接加入相应抗体，避光孵育30分钟；
[0055]步骤A23：在温度为4℃，离心力350xg的条件下，离心5分钟，去除上清，200μL Staining buffer重悬细胞，温度为4℃，离心力350xg的条件下，重复一次；
[0056]步骤A24：用100μL Fixation buffer重悬细胞，在温度为4℃的条件下，避光孵育20
‑
30分钟后，重复步骤A23。
[0057]实施例4
[0058]固定和破膜具体包括如下步骤：
[0059]步骤A31:增加100μL新配置的固定破膜buffer，在温度为4℃的条件下，避光孵育20
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30分钟。
[0060]步骤A32：重复步骤本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种异体间接干细胞追踪的方法，其特征在于：包括如下步骤：步骤S1：用blank，0.01M，0.05M,0.1M，0.5M，1M，5M和10M浓度的干细胞进行human Fc blocker孵育后进行固定buffer的固定后进行破膜试剂的破膜，各孵育30分钟后并进行相应的离心清洗后再进行相应胞内抗体的染色，后上机检测，仪器进行setup后，每日QC完成，进行正式样本的检测；步骤S1：将3只SD大鼠经过动物适应期后，使用干细胞进行输注，干细胞进入肺组织后安乐死并解剖去完整肺组织，取出肺各叶组织消化成单个细胞悬液，再进行Fc blocker孵育后进行固定buffer的固定后进行破膜试剂的破膜，各孵育30分钟并进行相应的离心清洗后再进行相应胞内抗体的染色，后上机检测，根据panel进行抗核抗原抗体和细胞骨架蛋白的检测，读取相应的表达强度和平均荧光强度结果，确认干细胞的分布和归巢数目。2.根据权利要求1所述的一种异体间接干细胞追踪的方法，其特征在于：所述的肺各叶组织消化具体包括如下步骤：步骤A1：肺组织消化；步骤A2：胞外抗体染色；步骤A3：固定和破膜；步骤A4：胞内/核内染色；步骤A5：仪器setup后上机检测。3.根据权利要求2所述的一种异体间接干细胞追踪的方法，其特征在于：所述的肺组织消化具体包括如下步骤：步骤A11：将肺组织使用DPBS清洗一次，去除相应的粘连物并剪碎；步骤A12：将已经剪碎的肺组织转移至消化酶中，放入GentleMACS Dissociators中并放置在37℃水浴锅中，消化30分钟；步骤A13：消化结束后，加入DPBS混合均匀，用70μm滤膜过滤；步骤A14：将过滤物用PBS清洗两次后，在转速为1500...

【专利技术属性】
技术研发人员：傅小聪，杨业国，袁曾津，
申请(专利权)人：上海派思维新生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：