验证FTO蛋白通过m6A参与小鼠GnRH调控FSH的方法及应用技术

本发明专利技术是一种验证蛋白通过m6A参与小鼠GnRH调控FSH过程的方法，包括GnRH处理、DAA处理、转染、提取、实时荧光定量PCR、蛋白质免疫印迹实验和酶联免疫吸附实验七个试验过程，通过检测小鼠促性腺激素细胞LβT2中Fshβ基因mRNA表达水平和FSH的分泌水平，发现FTO对Fshβ基因mRNA的表达有促进作用，能够促进小鼠FSH的分泌。FSH的分泌。FSH的分泌。

【技术实现步骤摘要】
验证FTO蛋白通过m6A参与小鼠GnRH调控FSH的方法及应用


[0001]本专利技术涉及一种验证FTO蛋白通过m6A参与小鼠GnRH调控FSH过程的方法，尤其是一种验证FTO蛋白通过m6A参与小鼠GnRH调控FSH的方法及应用，属于生物科技应用领域。

技术介绍

[0002]垂体因其能够分泌与许多生理过程有关的主要调节剂，并控制下游内分泌腺的活动，因此，被认为是哺乳动物最重要的内分泌器官之一。促卵泡素(FSH)作为垂体合成并分泌的七种激素之一，在哺乳动物的整个生命过程中发挥着不可估量的作用。
[0003]促性腺素释素(Gonadotropin
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Releasing Hormone，GnRH)，也称促性腺激素释放激素，GnRH是一种多肽荷尔蒙，在下丘脑中合成，它的主要功能是使垂体释放促卵泡素(FSH)和促黄体素(LH)，因此，FSH作为一种促性腺激素，普遍被认为是由GnRH驱动和调节的。
[0004]20世纪70年代，m6A修饰相继在小鼠、仓鼠、人类、病毒和其他生物体中被发现。已知RNA存在超过150种修饰。在真核生物中，5
’
端的Cap以及3
’
的ployA修饰在转录调控中起到了十分重要的作用，而mRNA的内部修饰则用于维持mRNA的稳定性。mRNA最常见的内部修饰包括N6
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腺苷酸甲基化(m6A)、N1
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腺苷酸甲基化(m1A)、胞嘧啶羟基化(m5C)等。对于大热的m6A，截至2017年，全球的科学家已经鉴定了参与m6A的许多酶，包括去甲基化酶、甲基化酶和甲基化识别酶等。
[0005]在迄今已发现的150多种化学RNA修饰中，m6A修饰被认为是真核生物信使RNA(mRNA)上最常见、最丰富的表观遗传学修饰。一旦参与m6A修饰的酶出现异常将会引起一系列疾病，包括肿瘤、神经性疾病、胚胎发育迟缓等。近年来，m6A修饰的作用在动物生殖领域逐渐被探索，例如已有研究报道METTL3缺失诱导的m6A修饰缺失能够导致RNA半衰期延长与异常剪接，导致整个转录组的基因表达紊乱，并加剧小脑颗粒层细胞的凋亡。
[0006]Wang HQ等[Comprehensive analysis of differences in N6
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methyladenosine RNA methylomes in the rat adenohypophysis after GnRH treatment,2022]研究发现，8周龄雄性SD大鼠经GnRH处理后，m6A的水平会有所变化，另外，现有研究表明，已经发生m6A修饰的碱基，在FTO(Fat mass and obesity
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associated protein)和ALKBH这两种酶的作用下发生去甲基化，即FTO具有调控m6A的功能。
[0007]但目前并没有现有技术可以直接支撑FTO和性腺激素分泌有直接影响，所以为了探究FTO蛋白是否能通过m6A途径参与到GnRH对FSH合成分泌的调控过程中，本专利技术提供了一种验证FTO蛋白通过m6A参与小鼠GnRH调控FSH的方法及应用，旨在准确判断FTO和FSH之间的关系。

技术实现思路

[0008]本专利技术目的在于为了探究FTO蛋白是否能通过m6A途径参与到GnRH对FSH合成分泌的调控过程中，为此，本专利技术提供了一种验证FTO蛋白通过m6A参与小鼠GnRH调控FSH的方法
及应用，为判断FTO和FSH之间的关系提供理论依据。
[0009]一种验证FTO蛋白通过m6A参与小鼠GnRH调控FSH的方法及应用，包括通过GnRH处理小鼠促性腺激素细胞LβT2，并检测小鼠促性腺激素细胞LβT2中m6A的含量，研究GnRH对小鼠促性腺激素细胞LβT2中m6A含量的影响；通过敲低/过表达小鼠促性腺激素细胞LβT2中FTO蛋白，检测小鼠促性腺激素细胞LβT2中Fshβ基因mRNA表达变化和FSH的分泌量，研究FTO蛋白对小鼠促性腺激素细胞LβT2中FSH含量的影响；通过利用m6A的甲基化抑制剂3
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deazaadenosine处理小鼠促性腺激素细胞LβT2，检测小鼠原代垂体细胞中Fshβ基因mRNA表达变化，证明FTO蛋白确实通过m6A参与小鼠GnRH调控FSH，具体为，
[0010]SA GnRH处理小鼠促性腺激素细胞LβT2实验
[0011]A1、取1mg GnRH加入8.458mL ddH2O制备成浓度为100μM的GnRH浓储液，取1μL GnRH浓储液于15mL离心管中，加入DMEM基础培养基至10mL，制备成浓度为10nM的GnRH工作液；
[0012]A2、接种LβT2细胞于12孔板中的2孔，每孔加入1mL完全培养基，37℃、浓度为5％的CO2培养箱中培养至每孔5
×
105个细胞；细胞培养结束后，吸出12孔板中培养LβT2细胞的2孔中的培养液并丢弃，每孔中加入500μL的1
×
PBS润洗，弃掉PBS后1孔中加入1mL的GnRH工作液，另1孔中加入1mL的DMEM基础培养基，混匀后，将12孔板置于37℃、浓度为5％的CO2培养箱中培养8小时；
[0013]A3、采用进行qPCR检测LβT2细胞中FTO、Fshβ、Lhβ、Cga、Gnrhr、Alkbh5、Gapdh基因mRNA表达水平；同时采用蛋白免疫印迹实验检测LβT2细胞中FTO蛋白的表达量；以及采用酶联免疫吸附实验检测LβT2细胞中m6A的含量、FSH与LH的分泌量；
[0014]SB敲低/过表达小鼠促性腺激素细胞LβT2中FTO蛋白实验
[0015]B1、取4个1.5mL离心管，每个离心管中加入100μL的基础培养基DMEM，并加入3μL的转染试剂，吹打混匀，室温孵育5min，制成4管转染试剂混合物；
[0016]B2、取4个1.5mL离心管，每个离心管中加入100μL的基础培养基DMEM，往这4个离心管中分别加入4μL的20μM阴性对照siRNA、4μL的20μM FTO siRNA、1μg的空质粒、1μg的FTO过表达质粒，吹打混匀，室温孵育5min；
[0017]B3、将B1中制得的4管转染试剂混合物分别加入B2的4个离心管中，吹打混匀，室温孵育20min；
[0018]B4、接种LβT2细胞于12孔板中的4孔，每孔加入1mL完全培养基，37℃、浓度为5％的CO2培养箱中培养至每孔5
×
105个细胞，细胞培养结束后，吸出12孔板中培养LβT2细胞的4孔中的培养液并丢弃，向每孔中加入500μL的1
×
PBS润洗，弃掉PBS后每孔中加入800μL的基础培养基DMEM，分别将B3中4管内的混合液加入该4个孔中，混匀，将12孔板置于37℃、浓度为5％的CO2培养箱中静置培养6小时进行转染，培养结束后弃掉孔中液体，每孔中加入1mL完全培养基，再次置于37℃、浓度为5％的CO2培养箱中静置培养；
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种验证FTO蛋白通过m6A参与小鼠GnRH调控FSH的方法及应用，其特征在于：包括通过GnRH处理小鼠促性腺激素细胞LβT2，并检测小鼠促性腺激素细胞LβT2中m6A的含量，研究GnRH对小鼠促性腺激素细胞LβT2中m6A含量的影响；通过敲低/过表达小鼠促性腺激素细胞LβT2中FTO蛋白，检测小鼠促性腺激素细胞LβT2中Fshβ基因mRNA表达变化和FSH的分泌量，研究FTO蛋白对小鼠促性腺激素细胞LβT2中FSH含量的影响；通过利用m6A的甲基化抑制剂3
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deazaadenosine处理小鼠促性腺激素细胞LβT2，检测小鼠原代垂体细胞中Fshβ基因mRNA表达变化，证明FTO蛋白确实通过m6A参与小鼠GnRH调控FSH，具体为，SA GnRH处理小鼠促性腺激素细胞LβT2实验A1、取1mg GnRH加入8.458mL ddH2O制备成浓度为100μM的GnRH浓储液，取1μL GnRH浓储液于15mL离心管中，加入DMEM基础培养基至10mL，制备成浓度为10nM的GnRH工作液；A2、接种LβT2细胞于12孔板中的2孔，每孔加入1mL完全培养基，37℃、浓度为5％的CO2培养箱中培养至每孔5
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105个细胞；细胞培养结束后，吸出12孔板中培养LβT2细胞的2孔中的培养液并丢弃，每孔中加入500μL的1
×
PBS润洗，弃掉PBS后1孔中加入1mL的GnRH工作液，另1孔中加入1mL的DMEM基础培养基，混匀后，将12孔板置于37℃、浓度为5％的CO2培养箱中培养8小时；A3、采用进行qPCR检测LβT2细胞中FTO、Fshβ、Lhβ、Cga、Gnrhr、Alkbh5、Gapdh基因mRNA表达水平；同时采用蛋白免疫印迹实验检测LβT2细胞中FTO蛋白的表达量；以及采用酶联免疫吸附实验检测LβT2细胞中m6A的含量、FSH与LH的分泌量；SB敲低/过表达小鼠促性腺激素细胞LβT2中FTO蛋白实验B1、取4个1.5mL离心管，每个离心管中加入100μL的基础培养基DMEM，并加入3μL的转染试剂，吹打混匀，室温孵育5min，制成4管转染试剂混合物；B2、取4个1.5mL离心管，每个离心管中加入100μL的基础培养基DMEM，往这4个离心管中分别加入4μL的20μM阴性对照siRNA、4μL的20μM FTO siRNA、1μg的空质粒、1μg的FTO过表达质粒，吹打混匀，室温孵育5min；B3、将B1中制得的4管转染试剂混合物分别加入B2的4个离心管中，吹打混匀，室温孵育20min；B4、接种LβT2细胞于12孔板中的4孔，每孔加入1mL完全培养基，37℃、浓度为5％的CO2培养箱中培养至每孔5
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105个细胞，细胞培养结束后，吸出12孔板中培养LβT2细胞的4孔中的培养液并丢弃，向每孔中加入500μL的1
×
PBS润洗，弃掉PBS后每孔中加入800μL的基础培养基DMEM，分别将B3中4管内的混合液加入该4个孔中，混匀，将12孔板置于37℃、浓度为5％的CO2培养箱中静置培养6小时进行转染，培养结束后弃掉孔中液体，每孔中加入1mL完全培养基，再次置于37℃、浓度为5％的CO2培养箱中静置培养；B5、从转染开始时计算，细胞培养24小时后收集细胞检测FTO、FshβmRNA表达，细胞培养48小时后收集细胞用以提取蛋白检测蛋白表达，采用蛋白免疫印迹实验检测LβT2细胞中FTO、Fshβ蛋白的表达量；以及采用酶联免疫吸附实验检测LβT2细胞FSH的分泌量；SC利用m6A的甲基化抑制剂3
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deazaadenosine处理小鼠促性腺激素细胞LβT2实验C 1、取1mg 3
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Deazaadenosine加入132.14μL DMSO制备成浓度为25mM的3
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Deazaadenosine浓储液，取5μL 3
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Deazaadenosine浓储液于15mL离心管中，加入完全培养基至5mL，制备浓度为25μM的3
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Deazaadenosine工作液；
C2、接种LβT2细胞于12孔板中的4孔，每孔加入1mL完全培养基，37℃、浓度为5％的CO2培养箱中培养至每孔5
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105个细胞，细胞培养结束后，吸出12孔板中培养LβT2细胞的4孔中的培养液并丢弃，每孔中加入500μL的1
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PBS润洗，弃掉PBS后按照所述B4中的转染实验步骤进行细胞转染实验，4孔中的2孔转染阴性对照siRNA，另外2孔转染FTO siRNA；C3、按照B4中的转染实验操...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁宝，王皓琪，姜昊，张嘉保，陈承祯，陈健，高妍，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：