一种ADC药物的体外药效检测方法技术

本发明专利技术提供一种ADC药物的体外药效检测方法。将ADC药物与抗原阳性细胞和/或抗原阴性细胞在第一培养体系中共培养，检测抗原阳性细胞和/或抗原阴性细胞的细胞活力；将ADC药物与抗原阳性细胞和抗原阴性细胞，或将ADC药物与抗原高表达或中表达的阳性细胞和抗原低表达的阳性细胞在第二培养体系中共培养，检测ADC药物对抗原阴性细胞或抗原低表达的阳性细胞的旁杀伤率，共培养时，第一培养体系和第二培养体系中分别采用成球培养基使细胞悬浮生长成球状。本发明专利技术方法能够使体外ADC药物与细胞的作用情况接近它们在体内的作用情况，提高ADC药物体内外药效检测结果一致性和旁杀伤活性检测的灵敏度，操作简单、适用性广泛、通量高。通量高。通量高。

【技术实现步骤摘要】
一种ADC药物的体外药效检测方法


[0001]本专利技术属于抗体偶联药物药效和特性检测的
，具体涉及一种ADC药物的体外药效检测方法。

技术介绍

[0002]抗体偶联药物 (antibody
‑
drug conjugate，ADC) 是将单克隆抗体与小分子细胞毒素用连接子连接，其结合了单克隆抗体的高特异性和小分子毒素的细胞杀伤活性，提高了肿瘤药物的靶向性并减少了毒副作用。ADC药物杀伤肿瘤细胞的一般药理机制为ADC药物中的抗体特异性识别并结合肿瘤细胞表面的抗原，ADC药物被抗原阳性细胞内吞进入细胞内，并在细胞内降解释放出小分子细胞毒素，小分子细胞毒素杀伤该抗原阳性细胞。同时，ADC药物还存在旁杀伤或旁观者杀伤作用（bystander killing effect），即抗原阳性细胞被杀伤后，小分子毒素被释放到该肿瘤细胞周围，膜通透性强的小分子毒素可以通过透过周围其他细胞的细胞膜，进一步杀伤周围其他细胞，包括抗原低表达肿瘤细胞或者抗原阴性肿瘤细胞。
[0003]体外药效评估是ADC分子筛选的重要步骤，筛选所得的候选药物将被用于后续的体内药效和毒理研究。体外药效主要分为两个部分：第一，通过检测细胞增殖和细胞毒性来评价ADC药物对抗原阳性肿瘤细胞的杀伤能力，常用的检测试剂盒有MTT试剂盒、CCK
‑
8试剂盒和CTG试剂盒等；第二，由于肿瘤异质性的广泛存在，以及肿瘤内部包含为肿瘤生长提供支持环境的间质细胞，评价ADC药物的旁杀伤作用也是当前评估ADC药物的重要指标之一。目前较为经典的ADC药物体外药效的检测方法有：1）基于传统细胞培养方式的CTG法，即基于ATP检测的细胞活力检测法；2）沿用第一三共株式会社用于检测Enhertu
®
旁杀伤作用的方法（抗原阳性细胞和阴性细胞共培养，ADC药物作用后，结合抗原阳性标记和细胞活力再分别统计抗原阳性细胞和抗原阴性细胞的数目）。随着重磅药Enhertu（德喜曲妥珠单抗，DS8201）的巨大成功，对于以拓扑异构酶1抑制剂依沙替康衍生物DXd及其类似分子作为小分子毒素的ADC药物的研究和应用大幅增加，对于具有旁杀伤作用的ADC药物的药效评价的需求也日益增加。但是随着研究的深入，渐渐发现使用上述检测方式时，ADC药物的体内外药效相差很大，包括出现体外检测无药效而体内有药效的情况，尤其在靶点中表达和低表达的阳性细胞上，现有体外检测方法很难检测出ADC药物活性，而在动物肿瘤模型中却显示出药效。由于体外药效检测往往是药物进行初步筛选的步骤，不理想的体外药效会导致此类ADC药物在进入体内药效评估环节前就被淘汰，进而错过较优的候选分子。

技术实现思路

[0004]本专利技术所要解决的技术问题是提供一种检测结果与体内药效结果一致性更高的ADC药物的体外药效检测方法。
[0005]为达到上述目的，本专利技术采用的技术方案是：一种ADC药物的体外药效检测方法，将ADC药物与抗原阳性细胞或抗原阴性细胞在
第一培养体系中共培养，分别检测抗原阳性细胞或抗原阴性细胞的细胞活力；或，将ADC药物与抗原阳性细胞和抗原阴性细胞在第一培养体系中共培养，检测抗原阳性细胞和抗原阴性细胞的总活力；将ADC药物与抗原阳性细胞和抗原阴性细胞在第二培养体系中共培养，检测ADC药物对抗原阴性细胞的旁杀伤率；或，将ADC药物与抗原高表达或抗原中表达的抗原阳性细胞和抗原低表达的抗原阳性细胞在第二培养体系中共培养，检测ADC药物对抗原低表达的抗原阳性细胞的旁杀伤率；其中，所述抗原阴性细胞为所述抗原阴性细胞和浓度小于等于15nM的ADC药物共培养时，ADC药物对其无杀伤作用的细胞，所述抗原低表达的抗原阳性细胞为所述抗原低表达的抗原阳性细胞和浓度小于等于15nM的ADC药物共培养时，ADC药物对其无杀伤作用且免疫组化实验测定为1+的细胞，所述抗原高表达的抗原阳性细胞为所述抗原高表达的抗原阳性细胞和浓度小于等于15nM的ADC药物共培养时，ADC药物对其有杀伤作用且免疫组化实验测定为3+的细胞，所述抗原中表达的抗原阳性细胞为所述抗原中表达的抗原阳性细胞和浓度小于等于15nM的ADC药物共培养时，ADC药物对其有杀伤作用且免疫组化实验测定为2+的细胞，所述抗原阴性细胞和所述抗原低表达的抗原阳性细胞分别携带荧光素酶基因，所述抗原能够与所述ADC药物中的抗体进行特异性结合，所述共培养时，所述第一培养体系和所述第二培养体系中分别采用低吸附性培养板，细胞悬浮生长成球状。
[0006]本专利技术中，免疫组化实验为本领域常规实验，利用组织细胞含有的抗原与相应单克隆抗体进行免疫结合，再用组织化学方法染色，显示细胞类型。其中，“免疫组化实验测定为1+”表示弱阳性：任何比例的细胞呈现微弱、不完整膜着色。“免疫组化实验测定为2+”表示阳性为：＞10%的细胞呈现弱至中等强度、完整但不均匀膜棕黄着色，或＜30%的细胞呈现强、完整膜棕褐色染色。“免疫组化实验测定为3+”表示强阳性：＞30%的细胞呈现强、完整膜棕褐色染色。
[0007]在一些实施方案中，所述杀伤作用是指药物处理后细胞活力相比相同培养条件下未使用药物处理的细胞活力低至少20%，30%，40%，或50%。
[0008]在一些实施方案中，所述无杀伤作用是指药物处理后细胞活力相比相同培养条件下未使用药物处理的细胞活力相差
±
10%及以内。
[0009]优选地，所述第一培养体系中抗原阳性细胞的接种数目为13000~20000个/孔，如13000，14000，15000，15500，16000，17000，18000，19000，20000个/孔。进一步优选地，所述第一培养体系中抗原阳性细胞的接种数目为13000~17000个/孔，更进一步优选为1400~16000个/孔。
[0010]优选地，所述第一培养体系中抗原阴性细胞的接种数目为13000~20000个/孔，如13000，14000，15000，15500，16000，17000，18000，19000，20000个/孔。进一步优选地，所述第一培养体系中抗原阴性细胞的接种数目为13000~17000个/孔，更进一步优选为1400~16000个/孔。
[0011]优选地，所述第一培养体系中抗原阳性细胞和抗原阴性细胞的接种总数目为20000~30000个/孔，如20000，21000，22000，23000，24000，25000，26000，27000，28000，
29000，30000个/孔。
[0012]优选地，所述第一培养体系中所述抗原阳性细胞和所述抗原阴性细胞的接种数目比为（3~5）：1，例如3：1，3.1：1，3.3：1，3.5：1，3.7：1，3.9：1，4：1，4.1：1，4.2：1，4.3：1，4.4：1，4.6：1，4.7：1或5：1。
[0013]优选地，所述第二培养体系中所述抗原阳性细胞和所述抗原阴性细胞的接种总数目，或所述抗原高表达或抗原中表达的抗原阳性细胞和所述抗原低表达的抗原阳性细胞的接种总数目为20本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种ADC药物的体外药效检测方法，其特征在于，将ADC药物与抗原阳性细胞或抗原阴性细胞在第一培养体系中共培养，分别检测抗原阳性细胞或抗原阴性细胞的细胞活力；或，将ADC药物与抗原阳性细胞和抗原阴性细胞在第一培养体系中共培养，检测抗原阳性细胞和抗原阴性细胞的总活力；将ADC药物与抗原阳性细胞和抗原阴性细胞在第二培养体系中共培养，检测ADC药物对抗原阴性细胞的旁杀伤率；或，将ADC药物与抗原高表达或抗原中表达的抗原阳性细胞和抗原低表达的抗原阳性细胞在第二培养体系中共培养，检测ADC药物对抗原低表达的抗原阳性细胞的旁杀伤率；其中，所述抗原阴性细胞为所述抗原阴性细胞和浓度小于等于15nM的ADC药物共培养时，ADC药物对其无杀伤作用的细胞，所述抗原低表达的抗原阳性细胞为所述抗原低表达的抗原阳性细胞和浓度小于等于15nM的ADC药物共培养时，ADC药物对其无杀伤作用且免疫组化实验测定为1+的细胞，所述抗原高表达的抗原阳性细胞为所述抗原高表达的抗原阳性细胞和浓度小于等于15nM的ADC药物共培养时，ADC药物对其有杀伤作用且免疫组化实验测定为3+的细胞，所述抗原中表达的抗原阳性细胞为所述抗原中表达的抗原阳性细胞和浓度小于等于15nM的ADC药物共培养时，ADC药物对其有杀伤作用且免疫组化实验测定为2+的细胞，所述抗原阴性细胞和所述抗原低表达的抗原阳性细胞分别携带荧光素酶基因，所述抗原能够与所述ADC药物中的抗体进行特异性结合，所述共培养时，所述第一培养体系和所述第二培养体系中分别采用低吸附性培养板，细胞悬浮生长成球状。2.根据权利要求1所述的ADC药物的体外药效检测方法，其特征在于，所述共培养时，所述第一培养体系和所述第二培养体系中采用的培养基分别为加入了肝素和氢化可的松的无血清培养基或加入了水凝胶的完全培养基；和/或，所述低吸附性培养板为水凝胶包被的细胞培养板。3.根据权利要求1或2所述的ADC药物的体外药效检测方法，其特征在于，所述第一培养体系中抗原阳性细胞的接种数目为13000~20000个/孔；和/或，所述第一培养体系中抗原阴性细胞的接种数目为13000~20000个/孔；和/或，所述第一培养体系中抗原阳性细胞和抗原阴性细胞的接种总数目为20000~30000个/孔；和/或，所述第二培养体系中所述抗原阳性细胞和所述抗原阴性细胞的接种总数目，或所述抗原高表达或抗原中表达的抗原阳性细胞和所述抗原低表达的抗原阳性细胞的接种总数目为20000~30000个/孔；和/或，所述第二培养体系中所述抗原阳性细胞和所述抗原阴性细胞的接种数目比，或所述抗原高表达或抗原中表达的抗原阳性细胞和所述抗原低表达的抗原阳性细胞的接种数目比为（3~5）：1。4.根据权利要求1所述的ADC药物的体外药效检测方法，其特征在于，在细胞接种后加入所述ADC药物。5.根据权利要求4所述的ADC药物的体外药效检测方法，其特征在于，在细胞接种的当天加入所述ADC药物，且在加入所述ADC药物后继续培养96 h~144 h。
6.根据权利要求1所述的ADC药物的体外药效检测方法，其特征在于，所述抗原包括肿瘤治疗靶点蛋白或免疫检查点蛋白；和/或，所述抗原包括HER2、HER3、EGFR、TROP2、CEACEM5、CD22、SIRPα、PD
‑
L2、PD
‑
L1、TIM3、CTLA4、CD103、LAG3、TIGIT、CD47、B7H3、B7H4、OX40或VISTA。7.根据权利要求1所述的AD...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐涵文，马赛，秦刚，
申请(专利权)人：启光德健医药科技苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：