一种肿瘤转移起始细胞的筛选方法与应用技术

本发明专利技术提供了一种肿瘤转移起始细胞的筛选方法与应用。所述筛选方法采用慢病毒荧光蛋白编码基因转染技术，建立荧光示踪的肿瘤细胞系，通过裸鼠脚踝皮下种植肿瘤细胞构建相应荧光可视肿瘤细胞淋巴结自发转移裸鼠模型；之后分离筛选得到淋巴结转移不同时期高转移的细胞，通过肿瘤细胞生物学特性检测得到肿瘤转移起始细胞。本发明专利技术从不同阶段淋巴结转移灶中寻找高转移细胞株，实现了对原发灶母系肿瘤细胞与不同转移时期淋巴结转移细胞的动态研究。本发明专利技术的筛选方法操作简单，可应用于不同肿瘤类型的肿瘤细胞系或临床组织中转移起始细胞的分离筛选，并应用于后续转移机理研究、抗肿瘤转移药物筛选以及肿瘤转移预后判断。转移药物筛选以及肿瘤转移预后判断。转移药物筛选以及肿瘤转移预后判断。

【技术实现步骤摘要】
一种肿瘤转移起始细胞的筛选方法与应用


[0001]本专利技术涉及生物医学以及细胞生物学
，尤其涉及一种肿瘤转移起始细胞的筛选方法与应用。

技术介绍

[0002]肿瘤转移是导致癌症患者死亡的主要原因。肿瘤转移主要取决于异质性群体中少数具有高转移潜能的细胞，这些独特的肿瘤细胞可能像干细胞一样具有启动转移能力，称之为转移起始细胞。转移起始细胞的分离及其分子表征的鉴定对肿瘤转移的基础医学研究和临床实践具有重要价值。然而，由于缺乏起始细胞转移特异性生物标志物，从疑似疾病组织的混合细胞群体中识别转移起始亚群仍然具有挑战性。
[0003]目前分离鉴定转移起始细胞的策略仅限于细胞表面标志物，由于缺乏多类型肿瘤普适且灵敏度和准确度高的标志物，这种方法难以获得不同特征的转移起始细胞。还可以利用血流剪切应力物理筛选，不过这种方法仅依据肿瘤经血道的一部分步骤，不适用于非血道转移的转移起始细胞筛选。
[0004]因此，现有的分离转移起始细胞亚群的方法还有待改进。

技术实现思路

[0005]鉴于上述现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种转移起始细胞的筛选方法与应用，旨在解决现有技术中缺乏针对多类型肿瘤普适，且准确度高的转移起始细胞筛选方法的问题。
[0006]本专利技术的技术方案如下：
[0007]一种肿瘤转移起始细胞的筛选方法，其中，包括步骤：
[0008]构建荧光标记肿瘤细胞；
[0009]将所述荧光标记肿瘤细胞种植入裸鼠体内，构建荧光标记肿瘤细胞的淋巴结自发转移裸鼠模型；
[0010]收集来自所述淋巴结自发转移裸鼠模型的小鼠肿瘤组织或淋巴结，从所述肿瘤组织或淋巴结中分离带有荧光标记的肿瘤细胞系；
[0011]对带有荧光标记的肿瘤细胞系进行鉴定，筛选得到肿瘤转移起始细胞。
[0012]所述的肿瘤转移起始细胞的筛选方法，其中，所述构建荧光标记肿瘤细胞的具体步骤包括：
[0013]将表达荧光蛋白的质粒与慢病毒包装质粒共转染到包装细胞中，产生荧光蛋白慢病毒；
[0014]将荧光蛋白慢病毒转导入肿瘤细胞，筛选得到表达荧光蛋白的所述荧光标记肿瘤细胞。
[0015]所述的肿瘤转移起始细胞的筛选方法，其中，所述肿瘤细胞包括食管鳞癌细胞、乳腺癌细胞、鼻咽癌细胞、肺癌细胞、胃癌细胞、肝癌细胞、胰腺癌细胞、肠道癌细胞中的一种。
[0016]所述的肿瘤转移起始细胞的筛选方法，其中，所述肿瘤细胞为人源的肿瘤细胞。
[0017]所述的肿瘤转移起始细胞的筛选方法，其中，构建荧光标记肿瘤细胞的淋巴结自发转移裸鼠模型之后，还包括：
[0018]通过体内成像检查所述荧光标记肿瘤细胞在裸鼠淋巴结内的转移；在种植荧光标记肿瘤细胞一定时间后，切除裸鼠种植部位的原发肿瘤和右侧腘窝淋巴结进行后续检查，通过荧光信号确认裸鼠淋巴结转移状况。
[0019]所述的肿瘤转移起始细胞的筛选方法，其中，收集来自所述淋巴结自发转移裸鼠模型的小鼠肿瘤组织或淋巴结，从所述肿瘤组织或淋巴结中分离带有荧光标记的肿瘤细胞系的具体步骤包括：
[0020]收集小鼠的肿瘤组织或淋巴结，并在无菌溶液中切碎；之后用胶原酶和DNA酶消化5
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30分分，同时手动涡旋；终止消化后，用细胞过滤器过滤，收集得到单细胞悬浮液；之后对单细胞悬浮液进行离心并收集细胞，得到肿瘤原代细胞；将所述肿瘤原代细胞在筛选培养基中培养，筛选得到所述带有荧光标记的肿瘤细胞系。
[0021]所述的肿瘤转移起始细胞的筛选方法，其中，所述带有荧光标记的肿瘤细胞系包括原发灶肿瘤细胞和自发淋巴结转移肿瘤细胞。
[0022]所述的肿瘤转移起始细胞的筛选方法，其中，筛选得到肿瘤转移起始细胞后，还包括：对所述肿瘤转移起始细胞进行生物学功能检测。
[0023]所述的肿瘤转移起始细胞的筛选方法，其中，所述生物学功能检测包括：通过单细胞测序进行转录组分析，通过功能实验进行增殖以及远端转移能力检测，细胞干性鉴定。
[0024]一种肿瘤转移起始细胞的筛选方法的应用，其中，将如上任一所述的筛选方法得到的肿瘤转移起始细胞在抗肿瘤转移药物筛选或者制备抑制肿瘤转移的靶向药物中的应用。
[0025]有益效果：本专利技术提供了一种肿瘤转移起始细胞的筛选方法与应用。先采用慢病毒荧光蛋白编码基因转染技术，建立荧光示踪的肿瘤细胞系；再通过裸鼠脚踝皮下种植肿瘤细胞构建相应荧光可视肿瘤细胞淋巴结自发转移裸鼠模型；之后分离筛选得到淋巴结转移不同时期高转移的细胞，最后通过肿瘤细胞生物学特性检测得到肿瘤转移起始细胞。本专利技术从不同阶段淋巴结转移灶中寻找高转移细胞株，实现了对原发灶母系肿瘤细胞与不同转移时期淋巴结转移细胞的动态研究；同时，通过建立的荧光可视自发淋巴结转移裸鼠模型，结合体内成像动态监测荧光强度对肿瘤自发转移情况进行动态监测，提高对早期自发淋巴结转移的细胞检测的敏感性，便于筛选肿瘤起始细胞。不仅如此，本专利技术的筛选方法操作简单，可应用于不同肿瘤类型的肿瘤细胞系或临床组织中转移起始细胞的分离筛选，并应用于后续转移机理研究、抗肿瘤转移药物筛选以及肿瘤转移预后判断。
附图说明
[0026]图1为本专利技术实施例提供的一种肿瘤转移起始细胞的筛选方法的流程图。
[0027]图2为本专利技术实施例提供的荧光可视人食管癌自发淋巴结转移裸鼠模型及原代细胞提取扩增示意图。
[0028]图3为本专利技术实施例提供的KYSE180母系细胞与KYSE180
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GFP细胞的绿色荧光强度的流式细胞对比图。
[0029]图4为本专利技术实施例提供的接种肿瘤细胞后第2、4及6周腘窝淋巴结内肿瘤细胞转移情况的流式细胞对比图。
[0030]图5为本专利技术实施例提供的自发淋巴结转移小鼠模型示意图以及食管癌自发淋巴结转移荧光可视细胞系来源淋巴结肿瘤转移情况示意图。
[0031]图6为本专利技术实施例提供的原发灶肿瘤细胞和早期、晚期淋巴结转移灶内肿瘤细胞的单细胞转录组分析。
[0032]图7为本专利技术实施例提供的细胞生长增殖及转移能力对比结果示意图。
[0033]图8为本专利技术实施例提供的细胞成球实验及免疫荧光鉴定结果示意图。
具体实施方式
[0034]本专利技术提供一种肿瘤转移起始细胞的筛选方法与应用，为使本专利技术的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本专利技术进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。
[0035]本专利技术实施例提供一种肿瘤转移起始细胞的筛选方法，如图1所示，包括步骤：
[0036]S10、构建荧光标记肿瘤细胞；
[0037]S20、将所述荧光标记肿瘤细胞种植入裸鼠体内，构建荧光标记肿瘤细胞的淋巴结自发转移裸鼠模型；
[0038]S30、收集来自所述淋巴结自发转移裸鼠模型的小鼠肿瘤组织或淋巴结，分离带有荧光标记的肿瘤细胞系；
[0039]S40、对带有荧光标记的肿瘤细胞系进行鉴定，筛选得到肿本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种肿瘤转移起始细胞的筛选方法，其特征在于，包括步骤：构建荧光标记肿瘤细胞；将所述荧光标记肿瘤细胞种植入裸鼠体内，构建荧光标记肿瘤细胞的淋巴结自发转移裸鼠模型；收集来自所述淋巴结自发转移裸鼠模型的小鼠肿瘤组织或淋巴结，从所述肿瘤组织或淋巴结中分离带有荧光标记的肿瘤细胞系；对带有荧光标记的肿瘤细胞系进行鉴定，筛选得到肿瘤转移起始细胞。2.根据权利要求1所述的肿瘤转移起始细胞的筛选方法，其特征在于，所述构建荧光标记肿瘤细胞的具体步骤包括：将表达荧光蛋白的质粒与慢病毒包装质粒共转染到包装细胞中，产生荧光蛋白慢病毒；将荧光蛋白慢病毒转导入肿瘤细胞，筛选得到表达荧光蛋白的所述荧光标记肿瘤细胞。3.根据权利要求2所述的肿瘤转移起始细胞的筛选方法，其特征在于，所述肿瘤细胞包括食管鳞癌细胞、乳腺癌细胞、鼻咽癌细胞、肺癌细胞、胃癌细胞、肝癌细胞、胰腺癌细胞、肠道癌细胞中的一种。4.根据权利要求2所述的肿瘤转移起始细胞的筛选方法，其特征在于，所述肿瘤细胞为人源的肿瘤细胞。5.根据权利要求1所述的肿瘤转移起始细胞的筛选方法，其特征在于，构建荧光标记肿瘤细胞的淋巴结自发转移裸鼠模型之后，还包括：通过体内成像检查所述荧光标记肿瘤细胞在裸鼠淋巴结内的转移；在种植荧光标记肿瘤细胞一定时间后，切除裸鼠种植部位的原发肿瘤和右侧腘窝淋巴结进行后续检查，通过荧光信号确认裸鼠淋巴结转移状况。6.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：李珊珊，黄翠翠，谭亚南，关新元，李咏梅，
申请(专利权)人：先进能源科学与技术广东省实验室，
类型：发明
国别省市：