一种针对多发性骨髓瘤的CAR-NK细胞制备方法技术

本发明专利技术公开了一种针对多发性骨髓瘤的CAR‑NK细胞制备方法。该方法包括如下步骤：使NK细胞表达融合蛋白，得到针对多发性骨髓瘤的CAR‑NK细胞；所述融合蛋白为将NK细胞表面激活受体CD244的IgG样结构域更换为针对多发性骨髓瘤标志物BCMA的特异性抗体后得到的重组蛋白。所述融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.1所示。本发明专利技术的技术方案对于具有多发性骨髓瘤标志物BCMA的肿瘤的治疗具有积极效果，可以用于具有多发性骨髓瘤标志物BCMA的肿瘤(如多发性骨髓瘤)的治疗。本发明专利技术具有重大的应用价值。

A CAR-NK cell preparation method for multiple myeloma

The present invention discloses a preparation method of CAR NK cells for multiple myeloma. The method includes the following steps: making NK cells express fusion proteins to obtain CAR -NK cells for multiple myeloma; the fusion protein is a recombinant protein obtained by replacing the IgG-like domain of NK cell surface activated receptor CD244 with a specific antibody against BCMA, a marker of multiple myeloma. The amino acid sequence of the fusion protein is shown in SEQ ID No.1. The technical scheme of the invention has a positive effect on the treatment of tumors with multiple myeloma marker BCMA, and can be used for the treatment of tumors with multiple myeloma marker BCMA, such as multiple myeloma. The invention has great application value.

【技术实现步骤摘要】
一种针对多发性骨髓瘤的CAR-NK细胞制备方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种针对多发性骨髓瘤的CAR-NK细胞制备方法。
技术介绍
近年来，嵌合抗原受体(chimericantigenreceptor，CAR)修饰的T细胞(CAR-T)在白血病研究中取得了重大突破，为血液肿瘤患者带来了新的希望。但是伴随着对血液肿瘤显著疗效的同时，CAR-T治疗也存在着一些问题，比如脱靶效应、细胞因子风暴、插入突变等，并且对实体瘤尚未取得显著疗效。研发新的具有强大抗肿瘤作用的效应细胞具有重要的理论意义和临床应用价值。NK细胞因其特殊的识别靶细胞的机制、短暂的生理周期、广泛的肿瘤杀伤能力等优势，被视为同样有潜力通过CAR修饰增强其抗肿瘤能力的效应细胞。NK细胞是一类对肿瘤细胞具有强力杀伤作用且MHC非依赖的淋巴细胞，其对肿瘤细胞的识别主要依赖于其表面活化性受体和抑制性受体的相互交叉调控。当识别肿瘤细胞之后，NK细胞通过释放杀伤介质穿孔素和颗粒酶使靶细胞凋亡、表达膜TNF家族分子诱导靶细胞凋亡和抗体依赖的细胞毒作用等多种途径杀伤肿瘤细胞。但是由于肿瘤患者体内NK细胞数量、质量的下降和肿瘤逃逸机制的存在，其在体内的抗肿瘤功能未能得到充分发挥。通过CAR修饰NK细胞有望增强其靶向杀伤肿瘤细胞的能力并研制出具有强大抗肿瘤作用的效应细胞。多发性骨髓瘤(MM)是一种恶性浆细胞病，其肿瘤细胞起源于骨髓中的浆细胞，而浆细胞是B淋巴细胞发育到最终功能阶段的细胞。因此多发性骨髓瘤可以归到B淋巴细胞淋巴瘤的范围。目前WHO将其归为B淋巴细胞淋巴瘤的一种，称为浆细胞骨髓瘤/浆细胞瘤，其特征为骨髓浆细胞异常增生伴有单克隆免疫球蛋白或轻链(M蛋白)过度生成，极少数患者可以是不产生M蛋白的未分泌型MM。多发性骨髓瘤常伴有多发性溶骨性损害、高钙血症、贫血、肾脏损害。由于正常免疫球蛋白的生成受抑，因此容易出现各种细菌性感染。目前没有针对多发性骨髓瘤的CAR-NK细胞免疫治疗技术。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种制备针对多发性骨髓瘤的CAR-NK细胞的方法。第一方面，本专利技术要求保护一种制备针对多发性骨髓瘤的CAR-NK细胞的方法。本专利技术所提供的制备针对多发性骨髓瘤的CAR-NK细胞的方法，可包括如下步骤：使NK细胞表达融合蛋白，得到针对多发性骨髓瘤的CAR-NK细胞。所述融合蛋白可为将NK细胞表面激活受体CD244(2B4)的IgG样结构域更换为针对多发性骨髓瘤标志物BCMA的特异性抗体后得到的重组蛋白。所述NK细胞表面激活受体CD244(2B4)的IgG样结构域的氨基酸序列具体可如序列表中序列3所示。所述针对多发性骨髓瘤标志物BCMA的特异性抗体的氨基酸序列具体可为SEQIDNo.1的第22-260位所示。进一步地，所述方法可包括如下步骤：将含有所述融合蛋白的编码基因的重组载体导入NK细胞，得到表达所述融合蛋白的NK细胞，即为所述针对多发性骨髓瘤的CAR-NK细胞。其中，所述融合蛋白自N端到C端依次由CD244(2B4)的上膜信号区、单链抗体区和“CD244(2B4)的跨膜结构与CD244(2B4)的胞内结构区”组成。所述CD244(2B4)的上膜信号区的氨基酸序列可为SEQIDNo.1的第1-21位所示。所述单链抗体区的氨基酸序列可为SEQIDNo.1的第22-260位所示。所述“CD244(2B4)的跨膜结构与CD244(2B4)的胞内结构区”的氨基酸序列可为SEQIDNo.1的第261-415位所示。更进一步地，所述融合蛋白的氨基酸序列可为SEQIDNo.1所示。对应于基因水平，所述融合蛋白的编码基因中编码所述CD244(2B4)的上膜信号区的核苷酸序列可为SEQIDNo.2的第1-63位所示。所述融合蛋白的编码基因中编码所述单链抗体区的核苷酸序列可为SEQIDNo.2的第64-780位所示。所述融合蛋白的编码基因中编码所述“CD244(2B4)的跨膜结构与CD244(2B4)的胞内结构区”的核苷酸序列可为SEQIDNo.2的第781-1248位所示。进一步地，所述融合蛋白的编码基因的核苷酸序列可为SEQIDNo.2所示。在所述方法中，所述重组载体可为重组慢病毒载体。相应的，所述方法可包括如下步骤：(a)利用所述重组慢病毒载体和慢病毒包装质粒转染慢病毒包装细胞，进行培养，获得重组慢病毒；(b)将所述重组慢病毒感染NK细胞，从而获得所述针对多发性骨髓瘤的CAR-NK细胞。在本专利技术的具体实施方式中，所述重组慢病毒载体具体为将SEQIDNo.2所示的所述融合蛋白的编码基因插入到plenti慢病毒载体的多克隆位点(BamHI和XbaI)之间后得到的重组质粒。所述慢病毒包装质粒具体为PspaX2质粒和PMD2.0G质粒。所述慢病毒包装细胞具体为293T细胞。在转染时，所述重组慢病毒载体、所述PspaX2质粒和所述PMD2.0G质粒的用量配比可为5：3.2：1.8(质量比)。更加具体的，如所述重组慢病毒载体、所述PspaX2质粒和所述PMD2.0G质粒分别为5μg、3.2μg、1.8μg，转染3×106个293T细胞。所述plenti慢病毒载体、所述PspaX2质粒和所述PMD2.0G质粒均可为addgene公司的产品，产品目录号分别为#17481、#12260和#12259。第二方面，本专利技术要求保护如下任一所示生物材料：(a1)利用前文所述方法制备得到的所述针对多发性骨髓瘤的CAR-NK细胞。(a2)前文所述融合蛋白。(a3)前文所述融合蛋白的编码基因。(a4)含有所述编码基因的重组载体、表达盒、重组菌或重组细胞；这里的重组载体可为前文任一所述的重组载体(可为重组慢病毒载体也可为重组非慢病毒载体)。第三方面，本专利技术要求保护如下任一所示应用：(A1)前文所述的针对多发性骨髓瘤的CAR-NK细胞在制备用于治疗具有多发性骨髓瘤标志物BCMA的肿瘤的产品中的应用；(A2)前文所述的针对多发性骨髓瘤的CAR-NK细胞在制备用于杀伤具有多发性骨髓瘤标志物BCMA的肿瘤细胞的产品中的应用；(A3)前文所述的编码基因、重组载体或表达盒在制备所述针对多发性骨髓瘤的CAR-NK细胞中的应用。进一步地，所述具有多发性骨髓瘤标志物BCMA的肿瘤可为多发性骨髓瘤。所述具有多发性骨髓瘤标志物BCMA的肿瘤细胞可为多发性骨髓瘤细胞。实验证明，CAR-NK细胞对具有多发性骨髓瘤标志物BCMA的肿瘤细胞(如多发性骨髓瘤细胞)具有杀伤效果，且CAR-NK细胞的使用量越高，杀伤效果越好。由此可见，本专利技术技术方案对于具有多发性骨髓瘤标志物BCMA的肿瘤(如多发性骨髓瘤)的治疗具有积极效果，可以用于具有多发性骨髓瘤标志物BCMA的肿瘤(如多发性骨髓瘤)的治疗。由于可以异体使用，将能使患者得到及时治疗。本专利技术具有重大的应用价值。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。plenti慢病毒载体、PspaX2质粒和PMD2.0G质粒均为addgene公司的产品，产品目录号分别为#17481、#12260和#12259。实施例1、针对多发性骨髓瘤的CAR-NK细胞的制备与鉴定针对多发性骨髓瘤的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种制备针对多发性骨髓瘤的CAR‑NK细胞的方法，包括如下步骤：使NK细胞表达融合蛋白，得到针对多发性骨髓瘤的CAR‑NK细胞；所述融合蛋白为将NK细胞表面激活受体CD244的IgG样结构域更换为针对多发性骨髓瘤标志物BCMA的特异性抗体后得到的重组蛋白。

【技术特征摘要】
1.一种制备针对多发性骨髓瘤的CAR-NK细胞的方法，包括如下步骤：使NK细胞表达融合蛋白，得到针对多发性骨髓瘤的CAR-NK细胞；所述融合蛋白为将NK细胞表面激活受体CD244的IgG样结构域更换为针对多发性骨髓瘤标志物BCMA的特异性抗体后得到的重组蛋白。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：将含有所述融合蛋白的编码基因的重组载体导入NK细胞，得到表达所述融合蛋白的NK细胞，即为所述针对多发性骨髓瘤的CAR-NK细胞。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述融合蛋白自N端到C端依次由CD244(2B4)的上膜信号区、单链抗体区和“CD244(2B4)的跨膜结构与CD244(2B4)的胞内结构区”组成。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述CD244(2B4)的上膜信号区的氨基酸序列为SEQIDNo.1的第1-21位所示；所述单链抗体区的氨基酸序列为SEQIDNo.1的第22-260位所示；所述“CD244(2B4)的跨膜结构与CD244(2B4)的胞内结构区”的氨基酸序列为SEQIDNo.1的第261-415位所示；进一步地，所述融合蛋白的氨基酸序列为SEQIDNo.1所示。5.根据权利要求2至4中任一所述的方法，其特征在于：所述融合蛋白的编码基因中编码所述CD244(2B4)的上膜信号区的核苷酸序列为SEQIDNo.2的第1-63位所示；所述融合蛋白的编码基因中编码所述单链抗体区的核苷酸序列为SEQIDNo.2的第64-780位所示；所述融合蛋白的编码基因中编码所述“CD244(2B4)的跨膜结构与CD244(2B4)的胞内结构区”的核苷酸序列为SEQIDNo.2的...

【专利技术属性】
技术研发人员：顾雨春，尹乐，
申请(专利权)人：北京呈诺医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11