人源化幽门螺旋杆菌cagA真核表达载体构建方法技术

本发明专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种人源化幽门螺旋杆菌cagA真核表达载体构建方法。所述构建方法包括密码子优化步骤，在所述密码子优化步骤中合成人源化cagA基因，所述人源化cagA基因的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO:1所示。本法构建得到人源化幽门螺旋杆菌cagA真核表达载体可在胃癌细胞中大量表达cagA蛋白，为研究cagA基因编码的蛋白的致癌致病机制创造了条件。本技术方案可应用于幽门螺旋杆菌的致病机制研究的实践中。

Construction of humanized cagA eukaryotic expression vector of Helicobacter pylori

The invention belongs to the field of biomedicine, in particular to a method for constructing a humanized cagA eukaryotic expression vector of Helicobacter pylori. The construction method comprises a codon optimization step in which the humanized cagA gene is synthesized. The nucleotide sequence of the humanized cagA gene is shown as SEQ ID NO:1 in the sequence table. The human cagA eukaryotic expression vector of Helicobacter pylori constructed by this method can express cagA protein in large quantities in gastric cancer cells, thus creating conditions for studying the carcinogenic mechanism of cagA gene-encoded protein. This technical scheme can be applied in the practice of pathogenesis research of Helicobacter pylori.

【技术实现步骤摘要】
人源化幽门螺旋杆菌cagA真核表达载体构建方法
本专利技术属于生物医药领域，具体涉及人源化幽门螺旋杆菌cagA真核表达载体构建方法。
技术介绍
幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,H.pylori)是一种螺旋状的革兰式阴性微需氧菌，感染全球一半的人口，是引起胃炎、消化性溃疡、胃癌的主要病因。在感染人群中，大多数人引起无症状性胃炎，大约有20—25％发展为慢性胃炎，10％发展为消化性溃疡，有1-3％发展为胃癌。胃癌的发生是多因素综合作用的结果，主要包括幽门螺旋杆菌感染、宿主遗传因素及环境因素。其中幽门螺旋杆菌感染是胃癌最重要的始发因素，已被世界卫生组织列为人类胃癌的Ⅰ类致癌因子。细胞毒素相关基因A(cytotoxinassociatedgeneA,cagA)编码的蛋白，是目前所知的唯一被幽门螺旋杆菌注入胃上皮细胞并能模拟细胞内蛋白发挥作用的“癌蛋白”，cagA基因编码的蛋白在细胞内被磷酸化后激活多种信号通路，参与胃癌的发生发展，但其致癌机制尚不完全清楚。为研究进一步研究cagA基因对胃癌发生相关信号通路的影响，本专利技术人PCR扩增出幽门螺旋杆菌cagA基因全长片段后构建克隆载体pMD18-T/cagA，经限制性酶切处理后，将原核载体上的cagA基因酶切后连接到pcDNA3.1/ZEO(-)真核表达载体上,构建真核表达载体pcDNA3.1ZEO(-)/cagA。将该真核表达载体转染胃癌细胞株，实现了cagA基因的真核表达，并检测到了cagA基因或cagA基因编码的蛋白对下游基因的调控作用。但上述技术方案存在以下问题：虽然将原核基因cagA构建到真核表达载体并实现了该原核基因的真核表达，但原核cagA基因在真核细胞中异源表达存在表达量较低并且表达水平不稳定，甚至在更换培养条件或胃癌细胞株时，经常出现基因不表达的情况，不能满足现阶段的进一步研究cagA调控通路的要求。因为cagA基因表达量过低或不表达，产生的相关蛋白量较少或无相关蛋白产生，不能够完全激活或不能激活所有cagA基因效应蛋白、效应基因或下游通路，使得对cagA基因引起胃癌的分子机制的深入研究受到了一定的限制。
技术实现思路
本专利技术主要解决的技术问题是提供一种人源化幽门螺旋杆菌cagA真核表达载体构建方法，该方法通过对幽门螺旋杆菌cagA基因进行密码子优化实现了cagA的人源化，利用人源化的cagA构建真核表达载体，可使人源化cagA基因在人胃癌细胞中高表达。为解决上述技术问题，本专利技术提出了一下技术方案：人源化幽门螺旋杆菌cagA真核表达载体构建方法，包括：(1)密码子优化步骤：合成核苷酸序列为SEQIDNO:1的人源化cagA基因；(2)人源化cagA真核表达载体构建步骤。在上述技术方案中，专利技术人对幽门螺旋杆菌cagA基因(NCBIsequenceID:KR154737)进行密码子优化，优化后的序列称为人源化cagA。人源化cagA与幽门螺旋杆菌cagA基因序列比对结果见图2，人源化cagA核苷酸序列见SEQIDNO:1。该技术方案的技术原理为：除甲硫氨酸和色氨酸，其他的氨基酸都对应2-6个密码子。其中编码同一种氨基酸的密码子称为同义密码子，在不同的生物或者细胞中，同义密码子被使用的频率也具有很大的差别，存在密码子偏好性。专利技术人对照人类密码子的偏好性，通过对幽门螺旋杆菌cagA基因的密码子进行优化处理。根据密码子偏好对幽门螺旋杆菌cagA基因的核苷酸序列进行改造后，专利技术人发现cagA基因在真核细胞中任然不能稳定和大量的表达。专利技术人在根据密码子偏好性进行的优化处理的基础上，对幽门螺旋杆菌cagA基因的模板链的3’端进行了改造，在3’端增加了一段核苷酸序列(5’-GACTACAAGGACGACGATGACAAG-3’)，该增加的核苷酸序列对人源化cagA基因在真核细胞中的表达起到了促进作用。专利技术人研究发现，629-817位氨基酸之间的区域和855-1048位氨基酸之间的区域为幽门螺旋杆菌cagA基因编码的蛋白的功能区域(内毒素功能，即致病功能)，而该蛋白的末端区域对蛋白内毒素功能的实现不起作用，所以对幽门螺旋杆菌cagA基因3’末端的改造虽然会在cagA编码的蛋白上增加几个氨基酸，但不会影响蛋白功能，增加的寡聚核苷酸对基因表达起到了调节作用。本技术方案达到的有益效果为：人源化cagA基因可在真核细胞中大量并稳定的表达，克服了幽门螺旋杆菌cagA在真核细胞中表达量小(甚至不表达)和表达不稳定的缺陷，为幽门螺旋杆菌致病机制和cagA引起胃癌分子机制的研究创造了条件。进一步，在所述人源化cagA基因的模板链的5’端设有NheⅠ限制性内切酶识别序列，在所述人源化cagA基因的模板链的3’端设有XbaⅠ限制性内切酶识别序列。采用上述技术方案，在人源化cagA基因中加入限制性酶切位点，可以通过酶切和连接等操作将人源化cagA基因连接到各类载体中。人源化cagA基因开放阅读框中不含有NheⅠ限制性酶切位点和XbaⅠ限制性酶切位点，从而保证了酶切操作不会把人源化cagA基因的开放阅读框切断，保证了人源化cagA基因的完整性。进一步，在所述人源化cagA基因的模板链的5’端设有Kozak序列，所述Kozak序列位于NheⅠ限制性内切酶识别序列和人源化cagA基因的起始密码子ATG之间。采用上述技术方案，技术原理如下：Kozak序列(Kozakconsensussequence)，是根据Kozak规则设计的序列，Kozak规则是基因起始密码子ATG的侧翼序列的碱基分布所满足的统计规律。Kozak序列应用于真核表达载体的构建中，当基因被转录为mRNA，核糖体能够识别mRNA上的这段序列，并把它作为翻译起始位点，从而增强基因在真核表达系统中的翻译效率，从而增加该基因编码的蛋白表达量。如果不设有Kozak序列，核糖体可能会和mRNA上错误的位点结合，从而出现翻译错误或翻译遗漏的情况。进一步，所述Kozak序列为5’-GCCACC-3’。采用上述技术方案，在限制性酶切位点之后和起始密码子ATG之前加入序列5’-GCCACC-3’，满足Kozak规则的要求，可以提高蛋白质翻译的正确率，从而提高基因的表达量。进一步，在所述密码子优化步骤中，通过聚合酶链式反应合成所述人源化cagA基因。采用上述技术方案，通过聚合酶链式反应(PCR)可实现人源化cagA基因体外合成。进一步，所述cagA真核表达载体构建步骤为：在pcDNA3.1(+)的NheⅠ位点和XbaⅠ位点之间，插入所述人源化cagA基因，得人源化cagA真核表达载体pcDNA3.1(+)-cagA。采用上述技术方案，pcDNA3.1(+)是常见的真核表达载体之一，可在DH5α等大肠杆菌中克隆复制，也可在哺乳细胞中表达蛋白。pcDNA3.1(+)中含有CMV启动子，该启动子可启动真核基因表达，具有较高的启动活性。利用pcDNA3.1(+)连接人源化cagA基因的核苷酸序列，构建源化cagA真核表达载体，可实现cagA基因编码的蛋白在真核细胞中的大量表达。在本步骤中得到的人源化cagA真核表达载体为pcDNA3.1(+)-cagA。进一步，在所述人源化cagA真核表达载体构建步骤之后还有转染步骤，所述转染步骤为：用本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.人源化幽门螺旋杆菌cagA真核表达载体构建方法，其特征在于，包括：(1)密码子优化步骤：合成核苷酸序列为SEQ ID NO:1的人源化cagA基因；(2)人源化cagA真核表达载体构建步骤。

【技术特征摘要】
1.人源化幽门螺旋杆菌cagA真核表达载体构建方法，其特征在于，包括：(1)密码子优化步骤：合成核苷酸序列为SEQIDNO:1的人源化cagA基因；(2)人源化cagA真核表达载体构建步骤。2.根据权利要求1所述的人源化幽门螺旋杆菌cagA真核表达载体构建方法，其特征在于，在所述人源化cagA基因的模板链的5’端设有NheⅠ限制性内切酶识别序列，在所述人源化cagA基因的模板链的3’端设有XbaⅠ限制性内切酶识别序列。3.根据权利要求2所述的人源化幽门螺旋杆菌cagA真核表达载体构建方法，其特征在于，在所述人源化cagA基因的模板链的5’端设有Kozak序列，所述Kozak序列位于NheⅠ限制性内切酶识别序列和人源化cagA基因的起始密码子ATG之间。4.根据权利要求3所述的人源化幽门螺旋杆菌cagA真核表达载体构建方法，其特征在于，所述Kozak序列为5’-GCCACC-3’。5.根据权利要求4所述的人源化幽门螺旋杆菌cagA真核表达载体构建方法，其特征在于，在所述密码子优化步骤中，通过聚合酶链式反应合成所述人源化cagA基因。6.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢渊，周建奖，
申请(专利权)人：贵州医科大学，
类型：发明
国别省市：贵州,52