基于CRISPR-Cas9靶向基因组修饰技术构建Egr2-Luciferase-KI-HEK293细胞系方法技术

本发明专利技术涉及一种基于CRISPR‑Cas9靶向基因组修饰技术构建Egr2‑Luciferase‑KI‑HEK293细胞系的方法，将靶向Egr2基因的打靶载体与打靶供体共转HEK293细胞系，使携带荧光素酶报告基因的打靶载体在Egr2基因组下游目标位点处正确重组，重组基因受内源性Egr2基因启动子的调控，获得单一稳定的Egr2‑Luciferase‑KI‑HEK293细胞系，并验证Egr2‑Luciferase‑KI‑HEK293细胞系中Luciferase表达变化是否能真实反映内源性Egr2基因的相对表达量及表达变化。为毛发生长和中枢神经系统相关研究提供一种新的实验思路及解决方案。

Construction of Egr2-Luciferase-KI-HEK293 Cell Line Based on RISPR-Cas9 Targeted Genome Modification

The present invention relates to a method for constructing Egr2 Luciferase KI HEK293 cell line based on CRISPR Cas9 targeted genome modification technology. The target vector targeting Egr2 gene is co-transfected with target donor to make the target vector carrying luciferase reporter gene recombine correctly at the downstream target site of Egr2 genome, and the recombinant gene is regulated by endogenous Egr2 gene promoter. To obtain a single stable Egr2 Luciferase KI HEK293 cell line, and to verify whether the change of Luciferase expression in Egr2 Luciferase KI HEK293 cell line can truly reflect the relative expression and expression of endogenous Egr2 gene. It provides a new experimental idea and solution for hair growth and related research of central nervous system.

【技术实现步骤摘要】
基于CRISPR-Cas9靶向基因组修饰技术构建Egr2-Luciferase-KI-HEK293细胞系方法
本专利技术属于生物技术和药理学领域，具体涉及一种基于CRISPR-Cas9靶向基因组修饰技术构建Egr2-Luciferase-KI-HEK293细胞系的新方法。
技术介绍
早期生长反应蛋白2(Earlygrowthresponseprotein2，Egr-2)属于即刻早期基因家族，Egr2可与富含GC序列的靶基因启动子特异序列结合具有转录激活作用，为转录因子。Egr2属于一个小的蛋白质亚家族，该家族还包括早期生长反应基因1(EGR-1，又名krox-24、Zif268、NGFI-A和TIS8)、早期生长反应基因3(EGR-3)和神经生长因子诱导的克隆C(nervegrowthfactor-inducedcloneC,NGFI-C)，这些蛋白可以与相似的DNA序列结合，但其作用的结构域不同。Egr2基因有4种转录本，编码2种亚型蛋白：转录本1～3编码亚型a，转录本4编码亚型b。Egr2基因结构在小鼠、鸡和人中都高度保守。Egr2基因编码的蛋白含有3个锌指结构：N-末端保守性较高；C-末端保守性较差；主要是以锌指结构与特异DNA序列结合，与该基因转录激活或抑制功能有关。研究发现，Egr2是多条信号通路调节的靶蛋白，一般被激活后会参与调控某些下游基因的表达，进而影响细胞或个体的生理功能。Egr2是施旺细胞(Schwanncell)的标志因子，也是一个调节髓鞘化的重要因子。在后脑发育、肿瘤抑制、外周神经髓鞘形成及单核细胞命运决定中都发挥着重要作用。Egr2本身的表达又受到诸多上游信号通路如Wnt、FGF等信号通路的调节，进而影响下游基因表达。头发是哺乳动物特有的专用表皮附属物。毛茸茸的大衣在温度调节中扮演着重要的角色，同时也起到伪装的作用。一些毛发，如胡须，已经演变为触觉器官，对动物行为很重要。在人类中，头发不那么重要，并且通常更多地被视为美容优势。毛囊提供了角质形成细胞的储库，它可以被募集到皮肤缺损的再上皮化。在胎儿期间，毛发从原始表皮发育而来。Egr2在毛囊分化中发挥重要作用，据研究报道，Egr2在毛基质中的表达会引起毛轴不同的分化特征。此外，Egr2在脂肪形成、施旺细胞及中枢神经系统的发育过程中也发挥重要作用。CRISPR是广泛存在于细菌和古细菌基因组中的规律成簇间隔短回文重复序列。CRISPR/Cas9系统是由最简单的typellCRISPR改造而来，该系统由单链的guideRNA和有核酸内切酶活性的Cas9蛋白构成。sgRNA将会引导编码的Cas蛋白(具有DNA核酸酶和解旋酶的活性)对靶基因DNA进行识别和特异性切割。所以通过人工设计具有引导作用的sgRNA(shortguideRNA)，可以引导Cas9对宿主细胞DNA进行定点切割，然后通过非同源末端连接(non-homologousendjoining，NHEJ)或同源重组(homologousrecombination，HR)两种修复途径的机制进行修复，实现基因编辑。目前，基于细胞转录激活检测的报告基因系统，是建立药物筛选模型的常用手段。传统检测基因表达调控的方法主要是通过RT-PCR、WesternBlot和将目标基因启动子克隆到携带报告基因的表达检测载体中等手段来实现。这些方法要么费时，繁琐，要么难以准确反映基因组上基因表达情况。基因编辑技术的发展，使得我们可以利用CRISPR/Cas9技术建立一种基于细胞内源性基因表达改变的新型报告系统，使报告基因的表达直接受内源靶基因启动子调控，能够真实反映细胞内真实的转录水平。荧光素酶报告基因已成为基础研究中常用的细胞标记与示踪的方法，其具有方便快捷、安全直观的优点。但是到目前为止，尚没有针对Egr2的新型报告系统，也没有更多的关于Egr2转录调控调节和新药筛选的文献资料可以参考。
技术实现思路
针对上述现有技术存在的问题，本专利技术的目的在于，提供一种基于CRISPR-Cas9靶向基因组修饰技术构建Egr2-Luciferase-KI-HEK293细胞系的方法，该细胞系是一种针对内源性Egr2表达水平检测的报告系统。为了实现上述任务，本专利技术采取如下的技术解决方案：一种基于CRISPR-Cas9靶向基因组修饰技术构建Egr2-Luciferase-KI-HEK293细胞系的方法，其特征在于，将靶向Egr2基因的打靶载体与打靶供体共转HEK293细胞系，使携带荧光素酶报告基因的打靶载体在Egr2基因组下游目标位点处正确重组，重组基因受内源性Egr2基因启动子的调控，获得单一稳定的Egr2-Luciferase-KI-HEK293细胞系，并验证Egr2-Luciferase-KI-HEK293细胞系中Luciferase表达变化是否可以真实反映内源性Egr2基因的相对表达量及表达变化。具体按下列步骤实施：(1)靶向Egr2基因3′非编码区的sgRNA的设计、构建sgRNA打靶载体及活性检测：在NCBI上查找Egr2基因的基因组序列，在其终止密码子下游选择四个sgRNA结合位点并设计合成相应的sgRNA引物，将sgRNA引物退火后连入pU6-sgRNA1.0，与携带Cas9的表达载体共转染HEK293细胞，转染72小时后，提取基因组DNA，对打靶区域进行PCR扩增，并利用T7E1法筛选最高切割活性的sgRNA；(2)构建携带Cas9、sgRNA表达元件的真核表达载体：将筛选获得的靶向Egr2基因的sgRNA表达元件、Cas9表达元件依次连入真核表达载体获得pCMV-Cas9-SV40pA-U6-sgRNAs-SV40pA片段；(3)构建靶向Egr2基因的打靶供体pUC19/Egr2-donor：靶向Egr2基因的打靶供体携带外源片段cDNA，包括T2A-Luciferase-CMV-eGFP-T2A-Neomycin-SV40pA片段，及其两端与断裂位点上下游分别具有相同序列的上、下游同源臂，该上、下游同源臂是长度约为1000bp的DNA片段。以人源化细胞基因组为模板，PCR扩增上、下游同源臂。依次连入携带T2A-Luciferase-CMV-eGFP-T2A-Neomycin-SV40pA元件的表达载体的两端。其中：上游同源臂序列如下：accgcctcctcctccttattctggctgtgcaggagacctctaccaggacccttctgcgttcctgtcagcagccaccacctccacctcttcctctctggcctacccaccacctccttcctatccatcccccaagccagccacggacccaggtctcttcccaatgatcccagactatcctggattctttccatctcagtgccagagagacctacatggtacagctggcccagaccgtaagccctttccctgcccactggacaccctgcgggtgccccctccactcactccactctctacaatccgtaactttaccctggggggccccagtgctggggtgaccggaccaggggccagtggaggcagcgagggaccccggctgcctggta本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于CRISPR‑Cas9靶向基因组修饰技术构建Egr2‑Luciferase‑KI‑HEK293细胞系的方法，其特征在于，将靶向Egr2基因的打靶载体与打靶供体共转HEK293细胞系，使携带荧光素酶报告基因的打靶载体在Egr2基因组下游目标位点处正确重组，重组基因受内源性Egr2基因启动子的调控，获得单一稳定的Egr2‑Luciferase‑KI‑HEK293细胞系，并验证Egr2‑Luciferase‑KI‑HEK293细胞系中Luciferase表达变化是否可以真实反映内源性Egr2基因的相对表达量及表达变化。

【技术特征摘要】
1.一种基于CRISPR-Cas9靶向基因组修饰技术构建Egr2-Luciferase-KI-HEK293细胞系的方法，其特征在于，将靶向Egr2基因的打靶载体与打靶供体共转HEK293细胞系，使携带荧光素酶报告基因的打靶载体在Egr2基因组下游目标位点处正确重组，重组基因受内源性Egr2基因启动子的调控，获得单一稳定的Egr2-Luciferase-KI-HEK293细胞系，并验证Egr2-Luciferase-KI-HEK293细胞系中Luciferase表达变化是否可以真实反映内源性Egr2基因的相对表达量及表达变化。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，具体按下列步骤实施：(1)靶向Egr2基因3′非编码区的sgRNA的设计、构建sgRNA打靶载体及活性检测：在NCBI上查找Egr2基因的基因组序列，在其终止密码子下游选择四个sgRNA结合位点并设计合成相应的sgRNA引物，将sgRNA引物退火后连入pU6-sgRNA1.0，与携带Cas9的表达载体共转染HEK293细胞，转染72小时后，提取基因组DNA，对打靶区域进行PCR扩增，并利用T7E1法筛选最高切割活性的sgRNA；(2)构建携带Cas9、sgRNA表达元件的真核表达载体：将筛选获得的靶向Egr2基因的sgRNA表达元件、Cas9表达元件依次连入真核表达载体获得pCMV-Cas9-SV40pA-U6-sgRNAs-SV40pA片段；(3)构建靶向Egr2基因的打靶供体pUC19/Egr2-donor：以人源化细胞基因组为模板，PCR扩增上、下游同源臂，依次连入携带T2A-Luciferase-CMV-eGFP-T2A-Neomycin-SV40pA元件的表达载体的两端；(4)Egr2-Luciferase细胞系的建立：将pCMV-Cas9-SV40pA-U6-sgRNAs-SV40pA片段与pUC19/Egr2-donor共转HEK293细胞系，待细胞系稳定后，加1.0mg/mL的G418筛选10天，待细胞系稳定后，再加10μg/mL的GCV筛选3周左右，待细胞系稳定过后，对细胞经有限稀释法进行克隆化，再对克隆化后的细胞进行PCR鉴定并测序，证实携带荧光素酶报告基因的打靶供体在目标位点处正确重组，最终获得单一稳定Egr2-Luciferase-KI-HEK293细胞系；(5)克隆并构建Egr2基因的转录激活因子表达载体：转录激活因子表达载体pUC19/CMV-AREB6，用于Egr2基因的转录激活实验研究；(6)验证Egr2-Luciferase-KI-HEK293细胞系中Luciferase表达变化是否可以真实反映内源性Egr2基因的相对表达量及表达变化：使用所构建的Egr2基因的转录激活因子AREB6表达载体pUC19/CMV-AREB6分别转染Egr2-Luciferase-KI-HEK293细胞系和野生型HEK293细胞系，并对Egr2-Luciferase-KI-HEK293细胞系中的Luciferase活性及HEK293细胞系中Egr2分子的mRNA表达水平分别进行检测；通过对knock-in细胞系中Luciferase表达活性与HEK293细胞中的Egr2mRNA表达水平及变化的比较，进一步验证Egr2-Luciferase-KI-HEK293细胞系中的Luciferase活性是否可以准确反映Egr2分子的相对表达变化。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的打靶载体携带pCMV-Cas9-SV40pA-U6-sgRNAs-SV40pA片段，既含有核酸酶Cas9表达框也含有靶向Egr2的打靶效率高的sgRNA表达组件。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的靶向Egr2基因的打靶供体携带外源片段cDNA，包括T2A-Luciferase-CMV-eGFP-T2A-Neomycin-SV40pA片段，及其两端与断裂位点上下游分别具有相同序列的上、下游同源臂，该上、下游同源臂是长度约为1000bp的DNA片段。5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述靶向Egr2的sgRNA其识别位点位于Egr2的终止密码子下游；其中：sgRNA1序列为：5′tggggacccctggccaaga3′；sgRNA2序列为：5′ccctttcctgtccctctct3′；sgRNA3序列为：5′ggggaggctcagaaggagg3′；sgRNA4序列为：5′gtgagttgactatcaaccca3′。合成的相应sgRNA，室温退火后连入pU6-sgRNA1.0，筛选后获得sgRNA表达组件，并检测其打靶效率。6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述上游同源臂序列如下：accgcctcctcctccttattctggctgtgcagg...

【专利技术属性】
技术研发人员：夏海滨，曹坤坤，
申请(专利权)人：陕西师范大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61