敲除乳腺上皮细胞NLRP3炎性体接头蛋白ASC基因的方法技术

本发明专利技术提供了一种基于CRISPR/Cas9技术敲除牛乳腺上皮细胞NLRP3炎性体接头蛋白ASC基因的方法。根据牛乳腺上皮细胞NLRP3炎性体接头蛋白ASC基因序列，构建基于CRISPR/Cas9系统的sgRNA表达载体，以此作为ASC基因打靶载体，转入牛乳腺上皮细胞中，获得ASC基因敲除的牛乳腺上皮细胞，可作为理想的用于研究奶牛乳腺炎性损伤以及奶牛乳腺炎的细胞模型，在奶牛乳腺炎的诊断试剂和药物筛选方面发挥应用。

Method of knocking out ASC gene of NLRP3 inflammatory body junction protein in mammary epithelial cells

The invention provides a method for knocking out the ASC gene of NLRP3 inflammatory body junction protein in bovine mammary epithelial cells based on RISPR/Cas9 technology. Based on the sequence of ASC gene of NLRP3 inflammatory body junction protein in bovine mammary epithelial cells, a sgRNA expression vector based on CRISP R/Cas9 system was constructed, which was used as a target vector of ASC gene and was transferred into bovine mammary epithelial cells to obtain bovine mammary epithelial cells knocked out by ASC gene. It can be used as an ideal cell model for the study of cow mammary inflammatory injury and cow mastitis. Inflammation diagnostic reagents and drug screening play an important role.

【技术实现步骤摘要】
敲除乳腺上皮细胞NLRP3炎性体接头蛋白ASC基因的方法
本专利技术涉及基因工程
，具体地说，涉及一种基于CRISPR/Cas9技术敲除牛乳腺上皮细胞NLRP3炎性体接头蛋白ASC基因的方法。
技术介绍
乳房炎是危害奶牛业的最重要疾病，每年造成巨大的经济损失及严重的食品卫生安全问题，其中大肠杆菌是引起奶牛乳房炎的主要致病菌。奶牛乳腺上皮细胞是研究大肠杆菌性乳房炎发病机制的模型，大肠杆菌能够诱导剧烈的奶牛炎症，但具体的作用机制仍不清楚。炎性体最初于2002年在人的单核细胞提取物中发现，是由包浆内模式识别受体(PRRs)参与组装的多蛋白复合物，是先天免疫系统中的重要组成部分。炎性体在感染、炎症和自身免疫性疾病的发生发展过程中发挥着极为重要的作用。炎性体主要由受体、接头蛋白及效应蛋白组成。目前已经鉴定出NLRP3、NLRP1、NLRC4和AIM2等多种炎性体受体。ASC是炎性体的接头蛋白，NLRP3受体等激活后可以招募ASC接头蛋白，进一步激活caspase-1效应蛋白，促进IL-1β及IL-18的成熟释放，调节炎症反应。除了依赖于ASC的NLRP3受体外，NLRP1及NLRC4受体可以不依赖于ASC直接激活caspase-1。大肠杆菌某些配体的炎性体已经确定，但仍有大量的受体不明确的配体能够促进caspase-1的激活。通过敲除炎性体接头蛋白ASC，不仅有利于确定大肠杆菌携带配体的炎性体受体，更为研究其他致病菌的作用机制提供了可行性。目前，基因编辑技术飞速发展。近些年来，由CRISPR/Cas9系统介导的基因编辑技术成为生物界获得基因敲除突变体的主流技术。该系统来源于细菌的免疫系统，其工作原理是crRNA(CRISPR-derivedRNA)通过碱基配对与tracrRNA(trans-activatingRNA)结合形成tracrRNA/crRNA复合物，此复合物引导核酸酶Cas9蛋白在与crRNA配对的序列靶位点剪切双链RNA。而通过人工设计这两种RNA，可以改造形成具有引导作用的sgRNA(shortguideRNA)，引导Cas9对DNA定点切割。通过人工合成与靶基因序列同源的sgRNA，可以直接实现对目标基因的编辑，并且这种基因的被编辑状态可以稳定遗传到下一代，无需CRISPR/Cas9外源T-DNA的持续存在。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种基于CRISPR/Cas9技术敲除牛乳腺上皮细胞NLRP3炎性体接头蛋白ASC基因的方法。为了实现本专利技术目的，本专利技术首先提供一种牛乳腺上皮细胞NLRP3炎性体接头蛋白ASC基因打靶载体，所述打靶载体是基于CRISPR/Cas9系统的sgRNA表达载体，sgRNA作用位点位于牛乳腺上皮细胞NLRP3炎性体接头蛋白ASC基因第一号外显子上，sgRNA作用位点的碱基序列为5′-CGATGCCATCCTGGATGCGC-3′。ASC基因Cas9结合区域示意图见图5。用于构建所述打靶载体的出发载体为pCRISPR-sg5质粒(图6)，由中国农业大学生命学院吴森老师馈赠，pCRISPR-sg5质粒可参见文献XuC,QiX,DuX,etal.piggyBacmediatesefficientinvivoCRISPRlibraryscreeningfortumorigenesisinmice[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,2017,114(4):722-727.所述打靶载体可以按以下方法构建得到：根据sgRNA作用位点的碱基序列，设计并合成编码所述sgRNA的Oligo片段，并人工合成其互补序列，将两条互补序列形成的双链DNA插入载体sg5的BbsI酶切位点上，即得。其中，所述双链DNA的序列如下：F5’-caccgCGATGCCATCCTGGATGCGC-3’R5’-aaacGCGCATCCAGGATGGCATCGc-3’本专利技术还提供所述打靶载体在制备NLRP3炎性体接头蛋白ASC基因敲除的牛乳腺上皮细胞中的应用。本专利技术还提供一种基于CRISPR/Cas9技术敲除牛乳腺上皮细胞NLRP3炎性体接头蛋白ASC基因的方法，其是根据牛乳腺上皮细胞NLRP3炎性体接头蛋白ASC基因序列，构建基于CRISPR/Cas9系统的sgRNA表达载体，以此作为ASC基因打靶载体，同时与质粒pCRISPR-W9和pCAG-Pbase共同转入牛乳腺上皮细胞中，获得ASC基因敲除的牛乳腺上皮细胞。质粒pCRISPR-W9和pCAG-Pbase的结构分别如图7和图8所示，由中国农业大学生命学院吴森老师馈赠，质粒pCRISPR-W9和pCAG-Pbase可参见文献XuC,QiX,DuX,etal.piggyBacmediatesefficientinvivoCRISPRlibraryscreeningfortumorigenesisinmice[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,2017,114(4):722-727.其中，sgRNA作用位点位于牛乳腺上皮细胞NLRP3炎性体接头蛋白ASC基因第一外显子上，sgRNA作用位点的DNA序列为5′-CGATGCCATCCTGGATGCGC-3′。所述打靶载体的出发载体为pCRISPR-sg5质粒。将打靶载体与质粒pCRISPR-W9和pCAG-PBase共同电转化至牛乳腺上皮细胞中。优选地，用Lonza电转仪T020程序进行电转。转化后的牛乳腺上皮细胞采用含有表皮生长因子10μg/ml，胰岛素5μg/ml和10％胎牛血清的DMEMF12培养基进行培养及传代。本专利技术还提供一种NLRP3炎性体接头蛋白ASC基因敲除的牛乳腺上皮细胞系，用本专利技术的打靶载体，同时与质粒pCRISPR-W9和pCAG-Pbase共同转化牛乳腺上皮细胞，获得的中靶阳性细胞克隆，即为NLRP3炎性体接头蛋白ASC基因敲除的牛乳腺上皮细胞系。用于鉴定中靶阳性细胞克隆的特异性PCR引物包括：引物F5’-CCAGGTTCCTGATTTGGCTAGCTA-3’引物R5’-GAAGTCTCGGTCCGGAGGCCAAGG-3’本专利技术还提供所述细胞系在奶牛乳腺炎病理机制研究中的应用。本专利技术进一步提供所述细胞系在奶牛乳腺炎的诊断试剂和药物筛选中的应用。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：(一)利用CRISPR/Cas9系统首次从牛乳腺上皮细胞中敲除NLRP3炎性体接头蛋白ASC基因，简便、快速，可作为理想的用于研究奶牛乳腺炎性损伤以及奶牛乳腺炎的细胞模型。(二)基于CRISPR/Cas9系统敲除ASC基因的方法，与沉默、干扰、敲低等手段相比，能够更有效地敲除ASC基因，有利于研究ASC蛋白的功能。(三)通过建立能够稳定敲除NLRP3炎性体接头蛋白ASC的奶牛乳腺上皮细胞，给对奶牛乳腺疾病及模型建立提供更多的研究基础，为临床深入研究提供有效手段；ASC基因稳定缺失的奶牛乳腺上皮细胞可以为奶牛乳腺炎性损伤及奶牛乳腺炎的防治机制及临床研究提供技术平台和理论支持。附图说明图1为本专利技术实施例1中基于CRISPR/Cas9技术敲除牛乳腺上皮细胞NLRP3炎性体接头蛋白ASC基因的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.牛乳腺上皮细胞NLRP3炎性体接头蛋白ASC基因打靶载体，其特征在于，所述打靶载体是基于CRISPR/Cas9系统的sgRNA表达载体，sgRNA作用位点位于牛乳腺上皮细胞NLRP3炎性体接头蛋白ASC基因第一外显子上，sgRNA作用位点的碱基序列为5′‑CGATGCCATCCTGGATGCGC‑3′。

【技术特征摘要】
1.牛乳腺上皮细胞NLRP3炎性体接头蛋白ASC基因打靶载体，其特征在于，所述打靶载体是基于CRISPR/Cas9系统的sgRNA表达载体，sgRNA作用位点位于牛乳腺上皮细胞NLRP3炎性体接头蛋白ASC基因第一外显子上，sgRNA作用位点的碱基序列为5′-CGATGCCATCCTGGATGCGC-3′。2.根据权利要求1所述的打靶载体，其特征在于，所述打靶载体的出发载体为pCRISPR-sg5质粒。3.根据权利要求2所述的打靶载体，其特征在于，所述打靶载体按以下方法构建得到：根据sgRNA作用位点的碱基序列，设计并合成编码所述sgRNA的Oligo片段，并人工合成其互补序列，将两条互补序列形成的双链DNA插入载体pCRISPR-sg5的BbsI酶切位点上，即得；其中，所述双链DNA的序列如下：F5’-caccgCGATGCCATCCTGGATGCGC-3’R5’-aaacGCGCATCCAGGATGGCATCGc-3’。4.权利要求1-3任一项所述打靶载体在制备NLRP3炎性体接头蛋白ASC基因敲除的牛乳腺上皮细胞中的应用。5.基于CRISPR/Cas9技术敲除牛乳腺上皮细胞NLRP3炎性体接头蛋白ASC基因的方法，其特征在于，其是根据牛乳腺上皮细胞NLRP3炎性体接头蛋白ASC基因序列，构建基于CRISPR/Cas9系统的sgRNA表达载体，以此作为ASC基因打靶载体，同时与质粒pCRISPR-W9和pCAG...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱要宏，吴琼，才冬杰，段聪，王九峰，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京,11