本发明专利技术提供了一种碱基编辑模拟、修复与甘露糖苷贮积症相关的MAN2B1
Base editing mimics and repairs MAN2B1 associated with mannoside storage disorder
The invention provides a base editing simulation and repair of MAN2B1 related to mannoside storage disorder.
【技术实现步骤摘要】
碱基编辑模拟、修复与甘露糖苷贮积症相关的MAN2B1C2248T突变的试剂和方法
本专利技术涉及基因修复领域，更具体来说，在人细胞中利用碱基编辑模拟、修复与甘露糖苷贮积症相关的MAN2B1C2248T(α-mannosidosis)相关突变的试剂和方法。
技术介绍
α-甘露糖苷贮积症(α-mannosidosis)是一种常染色体隐性遗传代谢病，主要是由于编码甘露糖苷酶的基因MAN2B1发生突变，导致α-甘露糖苷酶缺乏所引起的罕见溶酶体贮积症1。本病发病率大约为1/500000—1/1000000，在全球范围内均有发病。其临床症状多样，并没有一个统一的、独有的临床表型，主要表现为免疫缺失、听力受损、面容扭曲、骨骼发育异常、精神迟缓及其他并发症2。目前对α-甘露糖苷贮积症主要采用早期对症治疗，包括造血干细胞移植，酶替代疗法3。其中造血干细胞治疗必须权衡整个治疗过程相关的发病率和死亡率的风险，目前还不是一个最理想的选择；酶替代疗法只是暂时缓解症状，也不是一种最优选择。因此目前尚无特效疗法彻底根除此类疾病。鉴于α-甘露糖苷贮积症主要是由MAN2B1单基因突变引起的，对突变基因进行修复将是根治此类疾病的有效手段。高通量测序技术的发展与普及，使得我们可以获得更多的与疾病相关的突变，而如何对这些突变进行修复将是后基因组时代必须面对的问题。来自于细菌或古细菌中的CRISPR/Cas技术，自被应用于编辑哺乳动物细胞以来，已经成为基因编辑领域发展最快、应用最广的技术，引发了基因编辑领域的革命4。目前，CRISPR/Cas9系统已经被成功地用于DNA的敲除、敲入、替代、修饰、标记，RNA修饰和基因转录调节等研究5,6。并已经成功应用于多个物种的基因编辑6,7。CRISPR/Cas9介导的基因编辑是在sgRNA(singleguidedRNA)通过靶序列互补引导Cas9蛋白定位剪切双链DNA，造成双链DNA断裂(double-strandbreaks,DSB)，在没有模板的条件下，发生非同源末端连接修复，造成移码突变(frameshiftmutation)，导致基因敲除(knockout)；在有模板的条件下，通过同源重组进行修复，实现基因敲入(knockin)，由于HDR效率低(整合很少发生)，而且非同源性末端接合机制容易产生随机插入和删除(indel)，使得在断裂点附近可能随机引入新的碱基，从而导致不精确的基因编辑8。基于CRISPR/Cas9技术所构建的碱基编辑技术(Baseediting)，目前有胞嘧啶碱基编辑器(CBEs，cytosinebaseeditors)和鸟嘌呤碱基编辑器(ABEs，Adeninebaseeditors)。其能够在目标基因中精确而有效地引入点突变，而不需要双链DNA断裂或任何供体模板,展现出很大的基因编辑潜力9,10。目前利用碱基编辑，在酵母、植物、哺乳动物和人类细胞中进行了修正和遗传多样性研究11,12。MAN2B1基因位于人类第19号染色体上，该基因总长21.5kb13。目前HGMD突变数据库收录的和文献报道的MAN2B1基因突变已达一百多种，其中一半以上是错义或无义突变。其中一个错义突变c.2248C>T发生频率大约为27.5％。本专利技术将在人的细胞中利用碱基编辑技术实现安全高效地模拟与修复MAN2B1C2248T突变14,15，为临床上治疗相应突变引起的甘露糖苷贮积症提供可靠的试剂和方法。参考文献1.Paciotti,S,Codini,M,Tasegian,A,Ceccarini,MR,Cataldi,S,Arcuri,C,etal.(2017).Lysosomalalpha-mannosidaseandalpha-mannosidosis.FrontBiosci-Landmrk22:157-167.2.Lund,AM,Borgwardt,L,Cattaneo,F,Ardigo,D,Geraci,S,Gil-Campos,M,etal.(2018).Comprehensivelong-termefficacyandsafetyofrecombinanthumanalpha-mannosidase(velmanasealfa)treatmentinpatientswithalpha-mannosidosis.Journalofinheritedmetabolicdisease.3.吴晓昀,张杰,and郭奕斌(2013).α-甘露糖苷贮积症的分子遗传学及其在临床诊断与防治方面的意义.分子诊断与治疗杂志5:261-267.4.Gaj,T,Gersbach,CA,andBarbas,CF(2013).ZFN,TALEN,andCRISPR/Cas-basedmethodsforgenomeengineering.TrendsinBiotechnology31:397-405.5.Hsu,PatrickD,Lander,EricS,andZhang,F(2014).DevelopmentandApplicationsofCRISPR-Cas9forGenomeEngineering.Cell157:1262-1278.6.Komor,AC,Badran,AH,andLiu,DR(2017).CRISPR-BasedTechnologiesfortheManipulationofEukaryoticGenomes.Cell168:20-36.7.Barrangou,R,andDoudna,JA(2016).ApplicationsofCRISPRtechnologiesinresearchandbeyond.NatureBiotechnology34:933.8.Kosicki,M,Tomberg,K,andBradley,A(2018).Repairofdouble-strandbreaksinducedbyCRISPR–Cas9leadstolargedeletionsandcomplexrearrangements.Naturebiotechnology.9.Komor,AC,Kim,YB,Packer,MS,Zuris,JA,andLiu,DR(2016).ProgrammableeditingofatargetbaseingenomicDNAwithoutdouble-strandedDNAcleavage.Nature533:420-424.10.Gaudelli,NM,Komor,AC,Rees,HA,Packer,MS,Badran,AH,Bryson,DI,etal.(2017).ProgrammablebaseeditingofA*TtoG*CingenomicDNAwithoutDNAcleavage.Nature551:464-471.11.Ren,B,Yan,F,Kuang,Y,Li,N,Zhang,D,Zhou,X,etal.(2018).ImprovedBaseEditorforEfficientlyInducingGeneticVariationsinRicewithCRISPR/Cas9-GuidedHyperactivehAIDMutant.M本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种高效模拟、修复MAN2B1
【技术特征摘要】
1.一种高效模拟、修复MAN2B1C2248T突变的试剂盒，其特征在于，包括构建MAN2B1C2248T突变的碱基编辑系统BE及相应的mt-sgRNA以及针对MAN2B1C2248T突变修复的碱基编辑系统ABE及相应的re-sgRNA。2.如权利要求1所述的高效模拟、修复MAN2B1C2248T突变的试剂盒，其特征在于，所述的针对MAN2B1C2248T位点的突变mt-sgRNA的序列为SEQIDNO.1或SEQIDNO.3，针对该突变位点的修复re-sgRNA的序列为SEQIDNO.4。3.如权利要求1所述的高效模拟、修复MAN2B1C2248T突变的试剂盒，其特征在于，所述的碱基编辑系统为EE-XBE3和XABE。4.一种制作突变和修复突变的组合，其特征在于，包括根据MAN2B1C2248T位点...
【专利技术属性】
技术研发人员：马旭，李广磊，金孝华，刘馨怡，
申请(专利权)人：国家卫生计生委科学技术研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11
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