一种田菁酶法制备半乳甘露低聚糖的方法技术

本发明专利技术公开了一种田菁酶法制备半乳甘露低聚糖的方法，酶解底物为直接机械粉碎后的田菁种子；具体步骤包括：1）风干田菁种子机械粉碎至20-100目；2）将粉碎后的田菁种子与低β-甘露糖苷酶活力的β-甘露聚糖酶混合，加入水，加入pH缓冲液或酸、碱，混合至固液重量比1:3-50，控制pH值4-6，反应体系中每克半乳甘露聚糖的β-甘露聚糖酶用量为10-100U，于45-55℃的条件下反应12h以上；3）酶水解反应结束后，水解物于100℃下处理10min使β-甘露聚糖酶失活；4）水解物固液分离，清液即为半乳甘露低聚糖溶液。该方法具有工艺简单、有利于提高酶反应的底物和产物浓度，以及降低酶解反应搅拌能耗等优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于糖生物工程
，具体涉及一种田菁酶法制备半乳甘露低聚糖的 方法。
技术介绍
田菁是中国特有的一种耐涝、耐盐碱、耐贫瘠一年生灌木状草本豆科植物。在沿 海滩涂开发中，田菁是新垦盐碱地的先锋植物，在盐碱地上种植田菁，可以显著降低土壤盐 分，耕层盐分平均下降30-50%。但田菁的综合利用水平较低，目前茎叶主要作为绿肥植物 或粗饲料、部分种子用于生产田菁胶，附加值不高，制约了农民种植田菁的积极性。田菁种 子内胚乳主要成分为半乳甘露聚糖，是生产高附加值糖工程产品半乳甘露低聚糖的优质原 料。将田菁中的半乳甘露聚糖通过生物催化技术转化为半乳甘露低聚糖，可以大幅度提高 田菁的经济价值，从而激发农民种植田菁的积极性。 来源于田菁的半乳甘露低聚糖是由2-10个甘露糖通过0 -1，4-糖苷键形成直链、 半乳糖以a-1，6-糖苷键形成支链的一种低聚合度糖类。半乳甘露低聚糖是功能性低聚糖 的一种，它具有对双歧杆菌等肠道有益菌高选择性的增殖效应，阻断、抑制病原菌在消化道 中的定植和诱生免疫因子等功效，是一种优良的食品和饲料添加剂。 目前研宄较多的半乳甘露低聚糖制备方法主要是酶法，利用e -甘露聚糖酶选择 性降解半乳甘露聚糖，获得半乳甘露低聚糖。自然界中，绝大多数微生物在分泌甘露聚 糖酶的同时也分泌0-甘露糖苷酶。在甘露聚糖的酶法降解机理中，0-甘露聚糖酶的作 用是随机切断甘露聚糖分子中的0 -1，4-糖苷键，生成甘露低聚糖，随后生成的甘露低聚 糖在甘露糖苷酶作用下被降解成单糖。因此，在甘露聚糖酶法降解制备甘露低聚糖反 应体系中，甘露糖苷酶活力越低，则甘露聚糖水解生成的甘露低聚糖被甘露糖苷酶 降解的就越少，甘露低聚糖的得率越高。即用于降解甘露聚糖制备甘露低聚糖的甘露 聚糖酶必须是低甘露糖苷酶活力的甘露聚糖酶（酶液中甘露糖苷酶活力应尽 可能低）。低甘露糖苷酶活力的甘露聚糖酶的制备，可通过产酶微生物诱变、转基 因技术、调控发酵等手段获得，也可通过物理拆分的方法从0 _甘露聚糖酶酶液中拆分除 去0-甘露糖苷酶组分。 在已有的文献报道中，半乳甘露低聚糖的酶法制备均是采用甘露聚糖酶水解 从植物中提取的半乳甘露聚糖的方法。即首先采用热水抽提等方法从植物中提取半乳甘露 聚糖，然后以提取的半乳甘露聚糖为底物经甘露聚糖酶水解制备半乳甘露低聚糖。但 半乳甘露聚糖是一种水溶性多糖，其水溶液粘度大，因此如果直接以半乳甘露聚糖为酶反 应底物，一方面，高粘度的反应体系影响酶反应的传质和反应效率，另一方面，高粘度的反 应体系增加了搅拌器的动力消耗，同时，当以半乳甘露聚糖作为酶反应底物时，底物浓度受 到限制，只能保持在较低水平，导致反应体系中产物浓度较低，增加了后续产物分离纯化的 成本。例如，20g/L的半乳甘露聚糖溶液粘度高达750cps，要继续提高半乳甘露聚糖的浓度 十分困难。因此，降低以甘露聚糖为底物的酶反应体系的粘度是酶法降解甘露聚糖制备甘 露低聚糖研宄中需要重点突破的难题。
技术实现思路
专利技术目的：针对现有技术中存在的不足，本专利技术的目的是提供一种田菁酶法制备 半乳甘露低聚糖的方法，具有工艺简单、有利于提高酶反应的底物和产物浓度，以及降低酶 解反应搅拌能耗等优点。 技术方案：为实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案如下： -种田菁酶法制备半乳甘露低聚糖的方法，酶解底物为直接机械粉碎后的田菁种 子。 ，包括以下步骤： (1)风干田菁种子机械粉碎至20-100目； (2)将粉碎后的田菁种子与低e-甘露糖苷酶活力的e-甘露聚糖酶混合，加入 水，加入pH缓冲液或酸、碱，混合至固液重量比1:3-50,控制pH值4-6,反应体系中每克半 乳甘露聚糖的甘露聚糖酶用量为10-100U，于45-55°C的条件下反应12h以上； (3)酶水解反应结束后，水解物于100°C下处理lOmin使甘露聚糖酶失活； (4)水解物固液分离，清液即为半乳甘露低聚糖溶液。 所述的低甘露糖苷酶活力的甘露聚糖酶是通过微生物发酵制备，或从 0 _甘露聚糖酶系中通过物理方法拆分除去部分或全部0 _甘露糖苷酶组分后获得。 所述的0 _甘露聚糖酶是由里氏木霉（T. reesei)、黑曲霉（A. niger)等真菌或枯 草芽孢杆菌（B. subtilis)等细菌分泌的甘露聚糖酶。 所述的低0-甘露糖苷酶活力的0-甘露聚糖酶中，0-甘露聚糖酶活力甘 露糖苷酶活力不小于1〇〇。 本专利技术的方法，以富含半乳甘露聚糖的田菁种子粉碎后直接作为酶反应的底物， 使水溶性的半乳甘露聚糖在酶反应过程中主要以固相的方式存在于田菁种子颗粒中，避免 了水溶性半乳甘露聚糖溶解在水中引起的高粘度，在酶反应过程中逐渐溶出的或存在于固 相中的半乳甘露聚糖被体系中的甘露聚糖酶水解成低粘度的半乳甘露低聚糖，从而保 证了整个反应过程中体系的低粘度，有利于提高底物和产物浓度，降低酶解反应的搅拌能 耗并简化了工艺流程。 有益效果：与现有技术相比，本专利技术提出的以田菁种子粉碎后直接作为酶反应底 物，避免了水溶性半乳甘露聚糖溶解在水中引起的高粘度，同时在酶反应过程中逐渐溶出 的或存在于固相中的半乳甘露聚糖被体系中的甘露聚糖酶水解成低粘度的半乳甘露 低聚糖，从而保证了整个反应过程中体系的低粘度。具有工艺简单、有利于提高酶反应的底 物和产物浓度，以及降低酶解反应搅拌能耗等优点。【附图说明】 图1是含20g/L半乳甘露聚糖的田菁种子酶水解历程结果图； 图2是含60g/L半乳甘露聚糖的田菁种子酶水解历程结果图。【具体实施方式】 以下结合具体实施例对本专利技术作进一步的阐述。实施例是为说明而非限制本发 明。本领域中任何普通技术人员能够理解这些实施例不以任何方式限制本专利技术，可做适当 的修改而不违背本专利技术的实质和偏离本专利技术的范围。 实施例1里氏木霉合成低0 _甘露糖苷酶活力的0 _甘露聚糖酶 (1)产酶培养基组成（g/L):葡萄糖1.0,微晶纤维素25.0,硫酸铵4. 72,尿素 2. 15,磷酸二氢钾2. 0,无水氯化钙0. 3,七水硫酸镁0. 3,七水硫酸亚铁0. 005,七水硫酸锰 0. 0016,七水硫酸锌0. 0014,氯化钴0. 002。培养基用0. 05mol/L的柠檬酸钠缓冲液调节pH 值 4. 8。 (2)产酶条件：向产酶培养基中接种培养36h的里氏木霉种子，接种量为10%，于 温度26-32°C、摇床转速150-250转/分培养4d，离心，取上清测定0 -甘露聚糖酶活力和 0 -甘露糖苷酶活力。 (3) 甘露聚糖酶活力测定：25mL刻度试管中加入0.9mL用pH 5.0的柠檬酸-磷 酸氢二钠缓冲液配制的质量浓度为5. Og/L的洋槐豆胶底物溶液，50 °C预热5min，加入 0. lmL经适当稀释的酶液，于50°C下反应30min，立即加入3. OmL DNS试剂，煮沸7min，冷却 后定容至25mL，摇匀，在540nm下测定水解后产生的还原糖。以每分钟水解底物产生1 y mol 还原糖（以甘露糖计）的酶量定义为1个0 _甘露聚糖酶活力单位（U)。 (4) 0 -甘露糖苷酶活力测定： 在15mL试管中加入0. lmL适当稀释的酶液和0. 9mL lmmol/L的对硝基苯 酚-0-D-吡喃甘露糖苷（pNPM)溶本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种田菁酶法制备半乳甘露低聚糖的方法，其特征在于，酶解底物为直接机械粉碎后的田菁种子。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：勇强，杨磊，尹利旻，王静，李鑫，赖晨欢，徐勇，欧阳嘉，余世袁，
申请(专利权)人：南京林业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32