一种基因编辑U6启动子驱动的sgRNA表达组件的构建方法技术

本发明专利技术公开了一种基因编辑U6启动子驱动的sgRNA表达组件的构建方法，属于生物基因工程，本发明专利技术以人基因组的IDH1基因作为CRISPR/Cas9基因编辑的目的基因，通过设计sgRNA中基因特异性序列，获得完整的含有U6启动子的sgRNA表达组件序列，扩增U6‑sgRNA表达组件，合成U6‑sgRNA表达组件的PCR引物，并进行PAGE纯化，最后进行重叠PCR获得完整的U6‑sgRNA表达组件的双链DNA片段的步骤完成构建，整个构建方法基因编辑的成功率，不仅方便且成本低。

A Construction Method of sgRNA Expression Module Driven by Gene Editing U6 Promoter

The invention discloses a construction method of sgRNA expression module driven by gene editing U6 promoter, which belongs to biological genetic engineering. The IDH1 gene of human genome is used as the target gene of CRISPR/Cas9 gene editing. By designing gene specific sequence in sgRNA, the complete sgRNA expression module sequence containing U6 promoter is obtained, the U6_sgRNA expression module is amplified, and the U6_sgRNA expression module is synthesized. The primers of sgRNA expression module were purified by PAGE, and the complete double-stranded DNA fragments of U6 sgRNA expression module were constructed by overlapping PCR. The success rate of gene editing of the whole construction method was not only convenient but also low cost.

【技术实现步骤摘要】
一种基因编辑U6启动子驱动的sgRNA表达组件的构建方法
本专利技术涉及生物基因工程
，特别是指一种基因编辑U6启动子驱动的sgRNA表达组件的构建方法。
技术介绍
基因编辑是当今最热门的科研和治疗手段之一，可以对特定的基因序列进行修改编辑，目前已被广泛应用于科研中的基因功能研究、模式动物构建以及疾病的临床治疗等。基因编辑目前主要的系统包括ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9系统。由于ZFN和TALEN系统需要根据基因编辑的目的序列不同进行蛋白的重新构建，耗费的时间和成本较多，而CRISPR/Cas9系统仅仅需要针对目的基因的序列不同重新构建短链RNA序列即可，使用起来具有时效和成本的优势。在CRISPR/Cas9系统中，Cas9核酸酶需要crRNA和tracrRNA的协助识别目的序列，对目的序列进行剪切形成双链断裂。为了方便，人们之后将crRNA和tracrRNA整合起来形成一个RNA分子—sgRNA。当今利用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑需要两个重要组件，即sgRNA和Cas9核酸酶。在进行基因编辑时，sgRNA识别目的DNA序列，指导Cas9在特定序列进行剪切，形成双链断裂，随后依赖细胞本身的序列修复或者外源基因的同源重组实现基因编辑。基因编辑的特异性和位点选择依赖于sgRNA中特异性识别序列的不同设计，不同的sgRNA特异性识别序列的设计对应不同的靶点DNA序列，可见sgRNA，尤其是其特异性识别序列的设计和构建对基因编辑至关重要。同时，sgRNA作为一类非编码RNA，需要III型RNA聚合酶通过转录方式合成。所以，如何快速地构建含有III型RNA聚合酶启动子(比如U6启动子)的sgRNA表达组件至关重要。目前来说，主要有两种途径可以实现构建含有III型RNA聚合酶启动子的sgRNA表达组件。第一种技术方案，即通过合成sgRNA全长序列并将其插入含有III型RNA聚合酶启动子的载体质粒中，来获得含有III型RNA聚合酶启动子的sgRNA表达组件的方法。此方法虽比较快捷，但由于合成的片段不含III型RNA聚合酶启动子，依赖载体上的III型RNA聚合酶启动子，因而在选择载体时需使用含有III型RNA聚合酶启动子的载体，在载体的选择上缺乏灵活性，更换载体和体系较为繁琐，且在连接进入载体质粒时，可能出现反向连接的可能，需要进一步筛选和检验，效率较低。第二种技术方案，即全基因合成含有III型RNA聚合酶启动子的sgRNA表达组件，此方法较为直接，但是十分昂贵，如果遇到需要针对大量不同位点构建sgRNA表达组件的情况将耗费大量财力。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提出一种基因编辑U6启动子驱动的sgRNA表达组件的构建方法，用以克服现有技术中全部或者部分不足。基于上述目的本专利技术提供的一种基因编辑U6启动子驱动的sgRNA表达组件的构建方法，包括如下步骤：1)设计sgRNA中基因特异性序列：以人基因组的IDH1基因作为CRISPR/Cas9基因编辑的目的基因，进行序列设计，得到IDH1基因编辑的sgRNA基因特异性序列；2)获得完整的含有U6启动子的sgRNA表达组件序列：将步骤(1)得到的sgRNA基因特异性序列置于sgRNA表达组件的模板中，得到U6-sgRNA组件；3)获得U6-sgRNA表达组件的模板质粒：通过分子生物学手段获得的含有针对小鼠X染色体上非编码区域的U6-sgRNA-X组件连入pGEM-T载体，得质粒pGEM-T/U6-sgRNA-X，且序列为SEQIDNO.7；4)合成U6-sgRNA表达组件的PCR引物，并进行PAGE纯化，其中，所述引物序列如下，F1和F4为正向引物，F2和F3为反向引物；F1：5’-GGGGCTCGAGGAATTCACGCGTTGTACAAAAAAGCAGGCTTTAAAG-3’；F2：5’-AAGCGGCCGCAAGCTTACGCGTTAATGCCAACTTTGTACAAGAAAG-3’；F3：5’-AGTTTTAGCACTGGCACACCGGTGTTTCGTCCTTTCCACA-3’；F4：5’-GGTGTGCCAGTGCTAAAACTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG-3’；5)进行重叠PCR获得完整的U6-sgRNA表达组件的双链DNA片段。在一些可选实施例中，所述IDH1基因的编辑目的区段为IDH1ENSG00000138413,17230bp-17350bp。在一些可选实施例中，所述序列设计采用CRISPR设计网站Benchlin，并选取其中“On-TargetScore”较高且“Off-TargetScore”较低的以“G”为起始核苷酸的序列。在一些可选实施例中，所述sgRNA基因特异性序列为5’-GGTGTGCCAGTGCTAAAACT-3’。在一些可选实施例中，所述步骤(5)包括如下步骤：a)分别利用步骤(4)中合成的F1/F3引物以及F2/F4引物，以步骤(3)所述的pGEM-T/U6-sgRNA-X为模板进行PCR扩增；b)对步骤(a)中的反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，并分别进行凝胶回收大小为360bp的A片段和大小为159bp的B片段，并将A、B片段进行PCR扩增；c)将步骤(b)反应体系从PCR仪中取出，向其中加入引物F1和F2，再进行PCR扩增；d)对步骤(c)中的反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，并分别进行凝胶回收大小为499bp的U6-sgRNA表达组件的DNA片段；e)对(d)中回收的U6-sgRNA表达组件的DNA片段进行测序鉴定。在一些可选实施例中，所述步骤(a)的PCR扩增条件为98℃预变性30s；98℃10s，64℃30s，72℃30s循环30次；72℃充分延伸10min；4℃保持。在一些可选实施例中，所述步骤(b)的PCR扩增条件为98℃预变性30s；98℃10s，63℃30s，72℃30s循环10次；72℃充分延伸10min；4℃保持。在一些可选实施例中，所述步骤(c)的PCR扩增条件为98℃预变性30s；98℃10s，63℃30s，72℃30s循环25次；72℃充分延伸10min；4℃保持。在一些可选实施例中，所述步骤(e)中测序引物序列为5’-TGTACAAAAAAGCAGGCTTTAAAG-3’。从上面所述可以看出，本专利技术提供的一种基因编辑U6启动子驱动的sgRNA表达组件的构建方法，设计出sgRNA序列，所得的sgRNA序列处于III型RNA聚合酶启动子之下，可以保证sgRNA的有效表达，保证基因编辑的成功率；并采用三次PCR反应即可高效地获得含有III型RNA聚合酶启动子的sgRNA表达组件的DNA片段，操作方便；此设计仅需针对不同基因的特异性sgRNA序列设计合成F3和F4引物，F1、F2引物以及模板质粒都为通用，因而此方案不仅方便且成本低；引物F1和F2中含有常用的限制酶切位点，方便之后进行sgRNA的载体连接。附图说明图1为本专利技术现有技术中利用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑示意图；图2为本专利技术实施例设计sgRNA中基因特异性序列过程示意图；图3为本专利技术实施例进行重叠PCR获得完整的U6-sgRNA表达组件的双链DNA片段过程示意图；图4为本专利技术实施例U6本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基因编辑U6启动子驱动的sgRNA表达组件的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：1)设计sgRNA中基因特异性序列：以人基因组的IDH1基因作为CRISPR/Cas9基因编辑的目的基因，进行序列设计，得到IDH1基因编辑的sgRNA基因特异性序列；2)获得完整的含有U6启动子的sgRNA表达组件序列：将步骤(1)得到的sgRNA基因特异性序列与含有U6启动子序列的sgRNA表达组件模板进行连接，得到U6‑sgRNA组件；3)扩增U6‑sgRNA表达组件：通过分子生物学手段获得的含有针对小鼠X染色体上非编码区域的U6‑sgRNA‑X组件连入pGEM‑T载体，得质粒pGEM‑T/U6‑sgRNA‑X，且序列为SEQ ID NO.7；4)合成U6‑sgRNA表达组件的PCR引物，并进行PAGE纯化，其中，所述引物序列如下，F1和F4为正向引物，F2和F3为反向引物；F1：5’‑GGGGCTCGAGGAATTCACGCGTTGTACAAAAAAGCAGGCTTTAAAG‑3’；F2：5’‑AAGCGGCCGCAAGCTTACGCGTTAATGCCAACTTTGTACAAGAAAG‑3’；F3：5’‑AGTTTTAGCACTGGCACACCGGTGTTTCGTCCTTTCCACA‑3’；F4：5’‑GGTGTGCCAGTGCTAAAACTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG‑3’；5)进行重叠PCR获得完整的U6‑sgRNA表达组件的双链DNA片段。...

【技术特征摘要】
1.一种基因编辑U6启动子驱动的sgRNA表达组件的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：1)设计sgRNA中基因特异性序列：以人基因组的IDH1基因作为CRISPR/Cas9基因编辑的目的基因，进行序列设计，得到IDH1基因编辑的sgRNA基因特异性序列；2)获得完整的含有U6启动子的sgRNA表达组件序列：将步骤(1)得到的sgRNA基因特异性序列与含有U6启动子序列的sgRNA表达组件模板进行连接，得到U6-sgRNA组件；3)扩增U6-sgRNA表达组件：通过分子生物学手段获得的含有针对小鼠X染色体上非编码区域的U6-sgRNA-X组件连入pGEM-T载体，得质粒pGEM-T/U6-sgRNA-X，且序列为SEQIDNO.7；4)合成U6-sgRNA表达组件的PCR引物，并进行PAGE纯化，其中，所述引物序列如下，F1和F4为正向引物，F2和F3为反向引物；F1：5’-GGGGCTCGAGGAATTCACGCGTTGTACAAAAAAGCAGGCTTTAAAG-3’；F2：5’-AAGCGGCCGCAAGCTTACGCGTTAATGCCAACTTTGTACAAGAAAG-3’；F3：5’-AGTTTTAGCACTGGCACACCGGTGTTTCGTCCTTTCCACA-3’；F4：5’-GGTGTGCCAGTGCTAAAACTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG-3’；5)进行重叠PCR获得完整的U6-sgRNA表达组件的双链DNA片段。2.根据权利要求1所述的基因编辑U6启动子驱动的sgRNA表达组件的构建方法，其特征在于，所述IDH1基因的编辑目的区段为IDH1ENSG00000138413,17230bp-17350bp。3.根据权利要求1所述的基因编辑U6启动子驱动的sgRNA表达组件的构建方法，其特征在于，所述序列设计采用CRISPR设计网站Benchlin，并选取其中“On-TargetScore”较高且“Off-TargetScore”较低的以“G”为起始核苷酸的序列。...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈小鹏，吴深，朱国萍，徐峰，李蒙，张静宜，
申请(专利权)人：安徽师范大学，
类型：发明
国别省市：安徽,34