The invention provides a severe immunodeficient pig model and its construction method and application. The method uses BE3 point mutation tool to knock out RAG1, RAG2 and IL2RG genes to obtain immune deficient pig models. The invention obtains multi gene knockout immune deficiency pig models through C mutation T point mutation tool, which is safer, has higher immunodeficiency degree, and completely lacks T cells, B cells and NK cells. It is more conducive to the follow-up application research, the construction method is simple and efficient, and has broad application prospects and huge market value.
【技术实现步骤摘要】
一种重度免疫缺陷猪模型及其构建方法和应用
本专利技术属于生物
，涉及一种重度免疫缺陷猪模型及其构建方法和应用。
技术介绍
免疫缺陷小鼠在生物医药与基础研究领域发挥了重要的作用，但是由于小鼠与人之间的差异较大，在小鼠上经常会获得一些假阳性或假阴性的实验结果，严重限制了免疫缺陷小鼠的应用。而猪相较于小鼠与人有更多的相似性，包括体型大小、生理代谢水平和免疫系统等，因此建立免疫缺陷猪模型就具有更重要的现实意义。目前，免疫缺陷猪模型主要有以下几种：(1)利用基因打靶载体敲除IL2RG基因获得免疫缺陷猪，该模型表现为T细胞NK细胞缺失，B细胞功能异常；(2)利用TALENs敲除RAG1/2基因，该模型表现为T细胞B细胞缺失，NK细胞正常；(3)利用CRISPR/CSA9技术敲除RAG2和IL2RG基因，克隆猪表现为T细胞B细胞和NK细胞缺失。但是这些基因打靶方法基因敲除效率较低，同时CRISPR/CAS9具有一定的脱靶风险，很难更高效率更安全的获得多基因敲除的免疫缺陷猪模型。单一基因敲除免疫缺陷猪模型存在B细胞或者NK细胞，免疫缺陷程度不能达到后续实验应用的要求，利用C...
【技术保护点】
1.一种重度免疫缺陷猪模型的构建方法，其特征在于，所述方法利用BE3点突变工具敲除RAG1、RAG2和IL2RG基因获得免疫缺陷猪模型。
【技术特征摘要】
1.一种重度免疫缺陷猪模型的构建方法，其特征在于，所述方法利用BE3点突变工具敲除RAG1、RAG2和IL2RG基因获得免疫缺陷猪模型。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)根据猪的RAG1、RAG2和IL2RG基因序列，筛选gRNA位点；(2)将步骤(1)的gRNA连接至载体上，得到重组质粒；(3)将BE3质粒和步骤(2)的重组质粒转染细胞，筛选单细胞克隆；(4)将筛选的单克隆细胞的体细胞核与去核卵母细胞融合，移植到代孕母猪体内，鉴定得到重度免疫缺陷猪模型。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述gRNA包括RAG1的gRNA、RAG2的gRNA和IL2RG的gRNA；优选地，RAG1的gRNA的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；优选地，RAG2的gRNA的核苷酸序列如SEQIDN0.2所示；优选地，IL2RG的gRNA的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述载体包括U6-CAS9-gRNA骨架载体、RAG1-gRNA、RAG2-gRNA或IL2RG-gRNA中的任意一种，优选为U6-CAS9-gRNA骨架载体；优选地，步骤(2)所述重组质粒的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。5.根据权利要求2-4中任一项所述的方...
【专利技术属性】
技术研发人员：赖良学，王可品，葛维凯，刘琪帅，谢精科，
申请(专利权)人：中国科学院广州生物医药与健康研究院，
类型：发明
国别省市：广东,44
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