本发明专利技术涉及一种具有正常免疫功能的小鼠移植肿瘤模型的建立方法。利用野生型小鼠为载体，利用近源的、分子遗传背景清楚的携带人类肿瘤中常见的p53、Ras基因突变的p53-/-+S+Ras、p53-/-+V+Ras小鼠肿瘤细胞，成功建立了具有正常免疫功能的小鼠移植肿瘤模型。与已有的免疫缺陷的小鼠移植肿瘤模型相比，该模型较忠实地模拟了人类肿瘤疾病的情况，可用于评价通过提升机体免疫功能来达到抗肿瘤功效的药物。此方法建立的小鼠肿瘤模型周期短，重复性好。并且，由于使用了分子遗传背景清楚的小鼠肿瘤细胞，可以进行动物体内的药物作用分子机理研究。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于医药领域，具体地，涉及一种具有正常免疫功能的小鼠移植肿瘤模型 的建立方法，及其由该方法所获得的具有正常免疫功能的小鼠移植肿瘤模型，以及它们在 药学领域中的应用。
技术介绍
肿瘤是一类严重威胁人类健康的多发病和常见病，其发病机制尚未完全阐明，治 疗效果亦不尽人意。肿瘤在本质上是基因病，由各种环境的和遗传的致癌因素以协同或序 贯的方式引起。TP53基因是迄今发现与人类肿瘤抑制相关性最高的基因，在短短的十多年 里，人们对TP53基因的认识经历了癌蛋白抗原，癌基因到抑癌基因的三个认识转变，它在 正常情况下表达水平低且不稳定，当因DNA损伤激活时，核内的p53蛋白水平会急速升高， 激活的P53通过借助其转录激活区和序列特异性DNA结合区诱导其下游许多基因的转录 表达。现已认识到，引起肿瘤形成或细胞转化的P53蛋白是TP53基因突变的产物，是一种 肿瘤促进因子，它可能抑制正常P53蛋白的功能。在小鼠中，通过突变Trp53基因造成p53 蛋白的组成型激活，能够抑制肿瘤的发生，然而代价是导致了小鼠的提早衰老(premature ageing)。因而，野生型的p53具有监控细胞中的DNA损伤，促进异常细胞衰老或凋亡，从而 具有抑制肿瘤发生的功能。Ras基因首先在Harvery鼠肉瘤病毒(Ha2MSV)和Kirsten鼠 肉瘤病毒(Ki2MSV)的子代基因中被发现。在这种子代病毒中发现含有来源于宿主细胞的 基因组的新基因序列，此后人们将这种宿主细胞基因称为Ras基因。作为原癌基因的Ras 基因突变以后就变成有致癌活性的癌基因，其表达产物Ras蛋白发生构型改变，功能也随 之改变，与GDP的结合能力减弱，和GTP结合后不需外界生长信号的刺激便自身活化。此时 Ras蛋白内在的GTP酶活性降低，或影响了 GAP的活性，使Ras蛋白和GTP解离减少，失去了 GTP与⑶P的有节制的调节，活化状态的Ras蛋白持续地激活PLC产生第二信使，造成细胞 不可控制地增殖、恶变。人类大部分肿瘤中都存在p53、Ras基因突变。为更好地了解肿瘤的发病机制、肿瘤与宿主的关系、肿瘤侵袭与转移的过程和治 疗措施的有效性，需要建立合适的动物模型。小鼠模型目前已应用于肿瘤研究的各个领域。 1969年Raygard J首次将人结肠癌成功移植于裸鼠体内，并进行传代，开辟了应用动物研 究人类肿瘤的新领域；1983年Bosma首次报道了细胞和体液严重联合免疫缺陷的近交系小 鼠SCID小鼠，使得肿瘤的异体移植取得了更大进步。目前利用裸鼠及SCID小鼠进行异种肿 瘤移植已经成为肿瘤移植的主要方法。肿瘤的发生、增殖、浸润和转移的过程，就是肿瘤不 断逃避机体免疫系统攻击的过程。恶性肿瘤的免疫治疗是通过调动机体内部防御系统，达 到阻止肿瘤生长扩散的目的。恶性肿瘤在我国各类死因中位居第3位，临床上以手术治疗， 化学治疗结合免疫治疗为主。近年来，大量研究证实，中医药对机体免疫反应的作用是多方 面的。因裸鼠缺乏T细胞，SCID鼠同时缺乏T细胞和B细胞，它们存在免疫功能缺陷，不是 研究肿瘤免疫疗的最理想模型。故需要建立大量的具有正常免疫功能的小鼠移植肿瘤模型 用于研究以激发和增强病人免疫功能为手段，来控制杀灭肿瘤细胞，即肿瘤的免疫治疗，开展中医药抗肿瘤的免疫治疗药效研究。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种。本专利技术的下述技术方案是用来实现本专利技术的上述目的的小鼠移植肿瘤模型的建立方法，以具有正常免疫功能的C57/BL6小鼠为载体，接 种遗传背景相似且携带人类肿瘤中常见的p53、Ras基因突变的肿瘤细胞p53++S+Ras细胞 和只携带Ras基因突变肿瘤细胞p53++V+Ras，建立具有正常免疫功能的荷瘤小鼠模型。所述的小鼠移植肿瘤模型的建立方法，接种是先将p53++V+Ras和p53++S+Ras 细胞传代培养，再用无血清DMEM培养基制成1-5 XlO6Ail两细胞的悬液，取两细胞的悬液 分别接种于不同C57/BL6小鼠皮下，每个接种点约计IO5-IO6个细胞。由上述方法所建立的小鼠移植肿瘤模型。由上述方法所建立的小鼠移植肿瘤模型在评价药物的抗肿瘤功效中的应用。由上述方法所建立的小鼠移植肿瘤模型在评价通过提升机体免疫功能药物的抗 肿瘤功效中的应用。由上述方法所建立的小鼠移植肿瘤模型在药物抗肿瘤作用分子机理研究中的应用。应用本专利技术小鼠移植肿瘤模型的建立方法评价药物的抗肿瘤功效，评价通过提升 机体免疫功能药物的抗肿瘤功效，研究药物抗肿瘤作用分子机理。本专利技术的方法可概括为将表达Ras突变基因和p53突变基因(p53Q的载体转染 进P53+的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)，经过筛选，得到p53++S+Ras细胞株；将表达Ras突 变基因的载体和不携带P53基因的对照空载体转染进p53+的MEF细胞得到p53++V+Ras 细胞株。用注射器将上述两株肿瘤细胞(其中一株携带有P53突变蛋白p53S和Ras突变 蛋白，另一株只携带Ras突变蛋白的肿瘤细胞)的悬液分别接种于不同C57/BL6小鼠背部 皮下，建立具有正常免疫功能的荷瘤小鼠模型。附图说明图IA为皮下接种肿瘤细胞的小鼠14日后4接种点长出肿瘤；图IB为4接种点分离的肿瘤块。具体实施例方式下面结合附图，用本专利技术的实施例来进一步说明本专利技术的实质性内容，但并不以 此来限定本专利技术。实施例1:将表达 Ras 突变基因的载体(见 Serrano Μ, Lin AW, McCurrach ME, Beach D, Lowe Sff(1997). Oncogenic ras provokes premature cell senescence associated with accumulation of p53 andpl6INK4a. Cell 88 :593-602.)和表达p53突变基因(p53S)的载 体(见本申请人的另一项专利申请专利受理号200910095184. 3中的建立方法采用常规 的基因工程方法将p53突变基因cDNA连入PQCXIP载体，这样就可以表达p53突变基因)转染进P53+的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)，经过筛选，得到p53++S+Ras细胞株；将携带Ras 突变基因的载体和空质粒转染进P53+的MEF细胞得到p53++V+Ras细胞株。I)p53++V+Ras 和 p53++S+Ras 细胞加入 DMEM (10% FBS)体外传代培养。2)取两种细胞各6皿，吸去上清，加5mlPBS清洗一次，。3)胰酶消化后，加培养基，收集细胞入离心管。4) 1200rpm, 5min 离心，弃上清。5)加7mlDMEM(不含血清)，重悬浮，取100 μ 1进行细胞计数。6)用不含血清DMEM制成1_5X 106/ml两细胞的悬液。7)取两细胞的悬液分别接种于不同C57/BL6小鼠背部皮下，每只小鼠接种四个 点，每个接种点约计IO5-IO6个细胞。。8)两种细胞平均在注射十四、五天左右后就能观察到肿瘤(图1)，获得具有正常 免疫功能的同种小鼠移植肿瘤模型。实施例2 p53++V+Ras和p53++S+Ras细胞(见实施例上1部分将携带Ras基因的载体和 空质粒转染进p53+的MEF细胞得到p53++V+Ras细胞本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．小鼠移植肿瘤模型的建立方法，以具有正常免疫功能的Ｃ５７／ＢＬ６小鼠为载体，接种遗传背景相似且携带人类肿瘤中常见的ｐ５３、Ｒａｓ基因突变的肿瘤细胞ｐ５３－／－＋Ｓ＋Ｒａｓ细胞和只携带Ｒａｓ基因突变肿瘤细胞ｐ５３－／－＋Ｖ＋Ｒａｓ细胞，建立具有正常免疫功能的荷瘤小鼠模型。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：罗瑛，唐文如，赵兰君，
申请(专利权)人：昆明理工大学，
类型：发明
国别省市：53
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