The invention discloses a method for ubiquitination of T cell specific junction protein SLP 76, which comprises the following steps: constructing SLP 76 UBC9 fusion expression plasmid; providing SLP 76 carboxyl terminal modification plasmid; co-expressing the modified plasmid and SUMO1 expression plasmid in HEK 293T cells. The invention also provides a detection method for ubiquitination of T cell specific junction protein SLP type 76, including the following steps: Taking the cells to be added into the lysis buffer, centrifugation after placing on the ice, separating the protein by protein polyacrylamide gel electrophoresis, transferring the membrane, incubating the antibody of SUMO1 specific antibody and tagged protein /SLP 76 protein, matching the location of the protein strip, and determining the SLP Whether ubiquitination-like modification has occurred. The invention ensures the specificity, high efficiency and correctness of the identification of SLP 76 ubiquitination modification and has good repeatability.
【技术实现步骤摘要】
T细胞特异接头蛋白SLP-76类泛素化的方法及相应的体外高效鉴定
本专利技术涉及分子免疫学领域，具体涉及一种体外高效鉴定T细胞特异接头蛋白SLP-76类泛素化的方法。
技术介绍
T细胞是传染性和免疫性疾病研究的核心，在宿主抗胞内病原体感染免疫和内源性病变如肿瘤免疫，以及调度不同的免疫细胞功能中发挥着极其重要的作用。SLP-76是T细胞特异的免疫接头蛋白(immuneadaptors)，本身无酶活性，但在结构上常包含多种结构域功能区(domain)，通过这些功能区介导SLP-76和其它蛋白信号分子相互作用，实现一系列TCR信号传导的调控功能。其一级结构主要功能区包括一个酸性的N末端区、中部的脯氨酸和精氨酸富集区和C末端相对保守的SH2结构域。N末端区包含一个SAM功能区和三个酪氨酸磷酸化(活化)位点(Tyr-113、Tyr-128和Tyr-145)，能分别结合Nck、Vav和Itk的SH2区；而SAM功能区能介导SLP-76自身的聚合形成二聚体或多聚体并调控SLP-76微聚体的形成。SLP-76中部含有脯氨酸富集区和精氨酸富集区，前者与PLCγ1组成性结合，后者与G...
【技术保护点】
1.T细胞特异接头蛋白SLP‑76类泛素化的方法，其特征在于包括以下步骤：1)、构建SLP‑76‑UBC9融合蛋白表达质粒：将编码SLP‑76蛋白的序列插入pcDNA3‑MCS‑Ubc9质粒的多克隆位点内，从而构建SLP‑76‑UBC9融合表达质粒；编码SLP‑76‑UBC9融合蛋白的序列为：ATGGCACTGAGGAATGTGCCCTTTCGCTCAGAGGTCCTGGGCTGGGACCCCGACAGCCTTGCTGACTATTTCAAGAAGCTCAACTATAAGGACTGTGAGAAGGCAGTGAAGAAGTACCACATCGATGGGGCTCGCTTCTTGAA...
【技术特征摘要】
1.T细胞特异接头蛋白SLP-76类泛素化的方法，其特征在于包括以下步骤：1)、构建SLP-76-UBC9融合蛋白表达质粒：将编码SLP-76蛋白的序列插入pcDNA3-MCS-Ubc9质粒的多克隆位点内，从而构建SLP-76-UBC9融合表达质粒；编码SLP-76-UBC9融合蛋白的序列为：ATGGCACTGAGGAATGTGCCCTTTCGCTCAGAGGTCCTGGGCTGGGACCCCGACAGCCTTGCTGACTATTTCAAGAAGCTCAACTATAAGGACTGTGAGAAGGCAGTGAAGAAGTACCACATCGATGGGGCTCGCTTCTTGAACCTGACAGAAAATGACATCCAGAAGTTCCCCAAGCTCCGGGTGCCGATTCTCAGTAAGTTAAGTCAGGAAATCAACAAGAACGAAGAGAGGAGGAGCATCTTCACACGCAAACCCCAAGTCCCGCGGTTTCCTGAAGAGACAGAAAGCCACGAAGAGGACAATGGGGGCTGGTCGTCCTTTGAAGAAGACGATTATGAAAGTCCCAATGATGACCAGGATGGGGAGGATGATGGAGACTATGAGTCCCCCAATGAGGAGGAAGAGGCACCCGTGGAAGATGACGCGGATTATGAGCCGCCACCCTCCAATGACGAGGAAGCTCTGCAGAACTCCATCCTGCCTGCCAAGCCTTTCCCCAACTCCAACTCCATGTACATCGACCGGCCCCCCTCTGGGAAAACCCCCCAGCAGCCTCCTGTGCCCCCCCAGAGACCGATGGCCGCCCTCCCGCCCCCACCAGCCGGCCGGAATCACTCGCCACTGCCCCCACCCCAGACCAACCACGAAGAACCCAGCAGAAGCAGAAACCACAAAACGGCAAAGCTCCCTGCTCCTTCAATAGACAGAAGCACGAAACCTCCCCTAGATCGTTCATTAGCTCCGTTTGATAGAGAACCCTTCACACTAGGAAAGAAACCACCATTTTCTGACAAGCCCTCGATTCCAGCGGGAAGGTCACTCGGGGAGCATTTACCCAAGATTCAAAAGCCTCCTTTACCACCGACCACGGAAAGACATGAAAGGAGCAGCCCCCTGCCAGGGAAGAAGCCACCTGTGCCAAAGCATGGATGGGGACCAGACAGAAGAGAGAATGATGAAGATGATGTGCATCAGAGACCTTTGCCCCAGCCAGCACTACTTCCTATGAGCTCCAACACTTTCCCTTCAAGATCTACTAAGCCAAGTCCCATGAACCCTCTCCCATCCTCTCACATGCCTGGAGCATTCTCAGAAAGTAACAGCAGTTTTCCACAGAGTGCCTCCCTGCCACCATACTTCTCTCAAGGCCCTAGCAACAGACCACCTATCAGAGCCGAAGGCAGAAACTTCCCCTTGCCACTTCCAAACAAACCTCGGCCCCCATCCCCCGCGGAGGAAGAGAATTCATTAAATGAAGAGTGGTACGTTTCTTATATTACCCGACCAGAGGCAGAAGCTGCTCTTAGAAAGATAAACCAGGATGGCACATTTCTGGTCAGAGACAGCTCTAAAAAAACAACAACCAATCCATATGTCCTCATGGTGTTGTACAAAGATAAAGTTTACAACATCCAGATCCGTTATCAGAAGGAAAGTCAAGTTTACTTGTTGGGAACTGGACTCCGAGGGAAAGAGGACTTTCTGTCTGTGTCAGATATTATTGACTACTTCAGGAAAATGCCACTTCTGCTCATTGATGGGAAAAACCGAGGTTCCAGATACCAGTGCACATTAACGCATGCTGCAGGGTACCCACGAGGAGGATCGGGGATCGCCCTCAGCCGCCTTGCGCAGGAAAGGAAAGCCTGGAGGAAGGACCACCCTTTTGGCTTTGTAGCTGTCCCAACAAAGAACCCTGATGGCACAATGAACCTGATGAA...
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