用于检测葵花DNA的特异性引物和探针及实时荧光定量PCR试剂盒制造技术

本发明专利技术提供用于检测葵花DNA的特异性引物和探针，所述探针序列为：5’‑ACGCTCTCCTCGCCAACAACAA‑3’；所述特异性引物为下述序列或为下述序列的互补链序列：上游引物序列为5’‑CAAATAGTCCGCCCACCACAA‑3’；下游引物序列为5’‑5’‑TGGGAAGGGTTGTCAATGTTC‑3’。本发明专利技术还提供相应的实时荧光定量PCR试剂盒。本发明专利技术的特异性引物和探针以及相应试剂盒能够用于实时荧光定量PCR检测，且所建立的方法具有高敏感性和高特异性，能够从花生、胡麻、玉米、大豆、土豆、芝麻、油菜、核桃、葵花、橄榄等多种油料作物中特异性鉴别葵花油。

【技术实现步骤摘要】
用于检测葵花DNA的特异性引物和探针及实时荧光定量PCR试剂盒
本专利技术涉及分子生物学和体外诊断试剂
，尤其涉及一种用于葵花DNA检测的实时荧光PCR试剂盒，尤其涉及用于检测葵花DNA的特异性引物和探针。
技术介绍
检测食用油DNA质量的基因主要有叶绿体ATP、RBCL基因和物种特异性基因。设计的引物均源自叶绿体上rbcL基因序列。叶绿体是植物细胞重要的细胞器，叶绿体DNA被广泛用于系统进化的研究。叶绿体基因具有高度的保守型，而其中rbcL基因正是由于其进化特点而被广泛用于植物系统发生的研究。它的一些编码区在进化过程中速率较慢，比较保守，而一些非编码区在不同的物种间进化速度却比较快，具有一定的种间差异性和种内保守性，因而适合进行物种鉴别。通过对rbcL基因上一段序列进行通用引物设计，可以对不同的物种同时进行扩增，且同时具有种间差异性，在不同的物种之间差异比较大，易于进行物种鉴别。11S球蛋基因位于RBCL基因上，是合成葵花种子蛋白质的关键基因，具有很高的保守型。实时荧光定量PCR(FluorescencequantitativePCR)技术从常规PCR定性检测迈上量化的台阶，它相对常规PCR技术先进、操作简便、利用实时荧光定量PCR技术能够实现实时监测、绝对定量和快速检测的目的，同时具有灵敏度高、特异性好、操作便捷等优点，因此非常适合临床检测。实时荧光定量PCR技术有很多分支，其定量方式也不同，主要分为荧光染料嵌入技术、荧光探针技术和自身淬灭荧光技术等。荧光染料嵌入技术是利用SYBRgreenI嵌入DNA双链是荧光强度增加的特性，将荧光信号引入双链DNA，该方法特异性较差，结果常受到引物二聚体的存在的干扰而导致假阳性等问题，因此不适合用于食品快检。而荧光探针技术如Taqman技术、分子信标技术等因为其特异性比荧光染料嵌入技术和自身淬灭荧光技术要好，因此更适合食品检验使用。目前市场上频繁出现食用油掺假行为，而运用分子生物学技术对食用油进行掺假检测，首要前提是从油脂中提取出适合PCR扩增的DNA。由于精炼食用油生产需经过高温及高压等处理，其中的DNA降解为大小不一的碎片，且含量极低，这给DNA提取造成了很大困难。因而亟需构建快速、简便、准确和高效的常见食用油掺假分子生物学鉴别技术体系，为食用油质量监管和控制提供科学手段。
技术实现思路
本专利技术提供了用于检测葵花DNA的特异性引物和探针，还提供一种用于葵花DNA检测的实时荧光PCR试剂盒，具有快速、简便、准确、高效等优点，具有高敏感性和高特异性。本专利技术的第一个目的是提供用于检测葵花DNA的特异性引物和探针，所述探针序列为：5’-ACGCTCTCCTCGCCAACAACAA-3’；所述特异性引物为下述序列或为下述序列的互补链序列：上游引物序列为5’-CAAATAGTCCGCCCACCACAA-3’；下游引物序列为5’-5’-TGGGAAGGGTTGTCAATGTTC-3’。作为优选，探针中5’端标记的荧光报告基团为FAM、TET、JOE、HEX、VIC中的一种，3’端标记的荧光淬灭基团为TAMRA、DABCYL、BHQ中的一种。作为优选，所述上游引物和所述下游引物为向5’端和3’端方向延伸一至数个碱基或删减一至数个碱基得到的序列。本专利技术的第二个目的是提供一种用于检测葵花DNA的实时荧光定量PCR试剂盒，所述实时荧光定量PCR试剂盒包括权利要求1-3任一项所述的特异性引物和探针。作为优选，在10μlPCR反应体系中，所述上游引物的用量为0.1μl，所述下游引物的用量为0.1μl，所述探针的用量为0.2μl。作为优选，所述实时荧光定量PCR试剂盒还包括系列浓度标准品、阳性对照；所述标准品是将葵花11SRDNA基因与载体连接，转化至感受态细胞中诱导表达，提取重组质粒，将重组质粒定量后稀释，得到系列浓度标准品。作为优选，所述标准品的核苷酸序列为序列表中序列1。本专利技术的第三个目的是提供上述的特异性引物和探针、实时荧光定量PCR试剂盒在如下任一中的应用：(1)定性或定量检测或辅助检测葵花DNA；(2)制备定性或定量检测或辅助检测葵花DNA的产品；(3)定性或定量检测或辅助检测植物油中是否含有葵花油；(4)制备定性或定量检测或辅助检测植物油中是否含有葵花油的产品。本专利技术的第四个目的是提供一种检测或辅助检测植物油中是否含有葵花油的方法，分别以标准品和待测样品DNA为模板，利用特异性引物和探针进行实时荧光定量PCR，通过标准曲线和待测样品的Ct值判定结果；作为优选，所述待测样品DNA是使用冷冻干燥法提取的。作为优选，所述实时荧光定量PCR的反应条件为：94℃预变性2分钟，94℃15秒、60℃40s并收集荧光信号，40个循环。本专利技术与现有技术相比具有以下优点：1、本专利技术采用基因克隆技术，将葵花的11SrDNA基因片段插入到载体pMD18-T中，获得含有11SDNA基因片段的重组质粒，以此作为标准品。根据葵花11SrDNA的基因片段编码基因序列设计并合成一组特异性引物和探针，优化PCR反应条件，建立以实时荧光定量聚合酶链反应为平台的检测方法，并对所建立的方法进行评估：所建立的方法能够用于实时荧光定量PCR检测，且所建立的方法具有高敏感性(灵敏度为1.00×102copies/ml)和高特异性(能够从花生、胡麻、玉米、大豆、土豆、芝麻、油菜、核桃、葵花、橄榄等多种油料作物中特异性鉴别葵花油)。2、本专利技术通过提取待检测样品中的DNA，再结合实时荧光定量PCR检测技术，可达到准确定量待测标本中葵花油DNA含量的目的，可用于科研及食品检验中对葵花油DNA进行定性、定量分析，有利于开展食用油品种鉴别技术研究，将为食用油产品的质量安全管理提供科学手段，有利于国内食用油市场的规范、高端食用油进出口贸易的顺利进行和整个食用油行业的健康发展。3、本专利技术快速、简便、准确和高效。附图说明附图用来提供对本专利技术的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本专利技术的实施例一起用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的限制。在附图中：图1为葵花油11S基因与其他植物油基因进行blast比对的结果。图2-4为3对引物探针特异性BLAST比对结果。图5为将该最优引物对利用普通PCR方法扩增不同模板后，扩增产物电泳结果。图6为本专利技术引物和探针体系优化实验结果。其中，图中显示10μl体系时，a代表引物(5μM)加入0.1μl和探针(5μM)加入0.2μl；b代表引物(5μM)加入0.2μl和探针(5μM)加入0.1μl；c代表引物(5μM)加入0.1μl和探针(5μM)加入0.1μl；d代表引物(5μM)加入0.1μl和探针(5μM)加入0.3μl；e代表引物(5μM)加入0.3μl和探针(5μM)加入0.2μl；f代表引物(5μM)加入0.2μl和探针(5μM)加入0.2μl。图7为本专利技术葵花标准品的标准曲线。图8为本专利技术灵敏度实验结果。其中A1对应质粒浓度为1.00×109copies/ml、B1为1.00×108copies/ml、C1为1.00×107copies/ml、D1为1.00×106copies/ml、E1为1.00×105copies/ml、F1为1.00×104copies/ml、G1为1.00×本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于检测葵花DNA的特异性引物和探针，其特征在于：所述探针序列为：5’‑ACGCTCTCCTCGCCAACAACAA‑3’；所述特异性引物为下述序列或为下述序列的互补链序列：上游引物序列为5’‑CAAATAGTCCGCCCACCACAA‑3’；下游引物序列为5’‑5’‑TGGGAAGGGTTGTCAATGTTC‑3’。

【技术特征摘要】
1.用于检测葵花DNA的特异性引物和探针，其特征在于：所述探针序列为：5’-ACGCTCTCCTCGCCAACAACAA-3’；所述特异性引物为下述序列或为下述序列的互补链序列：上游引物序列为5’-CAAATAGTCCGCCCACCACAA-3’；下游引物序列为5’-5’-TGGGAAGGGTTGTCAATGTTC-3’。2.根据权利要求1所述的特异性引物和探针，其特征在于：探针中5’端标记的荧光报告基团为FAM、TET、JOE、HEX、VIC中的一种，3’端标记的荧光淬灭基团为TAMRA、DABCYL、BHQ中的一种。3.根据权利要求1所述的特异性引物和探针，其特征在于：所述上游引物和所述下游引物为向5’端和3’端方向延伸一至数个碱基或删减一至数个碱基得到的序列。4.一种用于检测葵花DNA的实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述实时荧光定量PCR试剂盒包括权利要求1-3任一项所述的特异性引物和探针。5.根据权利要求4所述的实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：在10μlPCR反应体系中，所述上游引物的用量为0.1μl，所述下游引物的用量为0.1μl，所述探针的用量为0.2μl。6.根据权利要求4或5所述的实时荧光定...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘宇琴，徐红，车团结，沈颂东，陈游，石文，张镭，李亚鹏，
申请(专利权)人：苏州百源基因技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32