ddPCR技术检测BCR/ABL融合基因的引物及其检测方法技术

本发明专利技术公开了一种ddPCR技术检测BCR/ABL融合基因的引物及其检测方法。以数字PCR为检测平台，针对3种型别的BCR/ABL融合基因，设计合成用于检测BCR/ABL融合基因上下游引物、BCR/ABL融合基因检测探针、内参基因的上下游引物和内参基因检测探针，并将待测样品cDNA模板、用于检测BCR/ABL融合基因上下游引物、BCR/ABL融合基因检测探针、内参基因的上下游引物、内参基因检测探针以及PCR预混液混合，制备ddPCR微反应液滴进行PCR扩增反应，根据荧光信号类型判断待测样品中是否含有融合基因模板及其数量和含量。本发明专利技术的引物和探针的设计特异性强，结合数字PCR技术检测灵敏度更高，通过软件自动化进行结果判读，避免产生假阴性结果，因此可以用于少量白血病细胞进行检测，减少患者复发的可能。

【技术实现步骤摘要】
ddPCR技术检测BCR/ABL融合基因的引物及其检测方法
本专利技术涉及生物
中基因的分子生物学检测，尤其涉及一种ddPCR技术检测BCR/ABL融合基因的引物及其检测方法。
技术介绍
abl为一原癌基因，位于9号染色体q34，基因产物是一种非受体型酪氨酸蛋白激酶；bcr基因位于22号染色体q11，正常的bcr基因产物为160kD的胞质磷酸蛋白，由于t(9；22)(q34；q11)的易位，形成bcr/abl融合基因，该易位产生bcr/abl嵌合基因，基因产物为210kD的融合蛋白，它的表达激活了酪氨酸蛋白激酶，改变了细胞的蛋白酪氨酸水平和肌动蛋白结合能力，扰乱了正常的信号传导途径，抑制了凋亡的发生。bcr基因断裂点集中在三个区域:主要(majorbcr，M-bcr)、次要(minorbcr，m-bcr)和μ(μ-bcr)。abl基因断裂位于第1或第2内含子。因断裂点不一，bcr-abl融合基因及其mRNA和蛋白产物呈多样性。根据bcr基因断裂点的不同，主要有下述几种类型的bcr/abl融合形式:①在典型的CML中，大部分融合基因是在主要断裂点簇集区(M-bcr)内断裂融合而成，由此形成的bcr/abl融合mRNA是由b3a2或b2a2转录而成，其最终产物是相对分子质量210×103的胞浆蛋白P210，这种癌蛋白是绝大多数慢性期CML表型异常的根源所在；②当bcr基因断裂点发生在上游的一段长约54.4kb的内含子，也称m-bcr区，产生一个e1a2接头的杂合mRNA，编码P190融合蛋白；③bcr断裂点也可在M-bcr区的下游，即μ-bcr，产生e19a2融合，编码P230融合蛋白。bcr/abl融合基因存在于95％以上的慢性粒细胞白血病患者，是CML最重要的分标志，是疾病状态的决定性因素。在一部分成人急性淋巴细胞性白血病(20％－30％)、儿童急性淋巴细胞白血病(2％－10％)和急性粒细胞性白血病的患者中也可表达bcr/abl融合基因。目前常用的检测BCR/ABL融合基因导致慢性髓细胞白血病(CML)和急性淋巴细胞白血病(ALL)有以下5种方法，(1)形态学检查，由于白血病细胞的高度异质性和多态性，重复性差，易受主观因素的影响，其诊断一致率约60％-80％。(2)免疫学检测方法，主要有两种：细胞涂片法和流式细胞术(FCM)，细胞涂片法所需设备简单，可在显微镜下清楚地判断细胞抗原和抗体结合的部位，尤其对细胞内抗原进行检测时较易排除因细胞膜渗透处理带来的非特异性反应，但目测不易对大量细胞进行计数，故敏感度较低，一般为10-2，目前主要用于细胞内抗原的检测；而FCM可同时对一个细胞中2个以上的抗原进行检测，并对大量细胞进行快速分析，准确客观、简单方便，但是FCM法需特殊仪器，操作技术要求高，价格昂贵，结果的重复性欠佳。(3)细胞遗传学检测方法，常规应用直接法或短期培养法进行染色体RHG显带，但是白血病细胞分裂指数低，染色体形态短小，常显带不清，使得一些结构复杂或细微的改变难以准确识别。(4)荧光原位杂交(FISH)，FISH技术灵敏度高，取材方便，骨髓或外周血均可作为研究对象，不仅对分裂中期细胞，而且对间期核细胞均能检测到，对隐匿型、变异型也可同样进行检测分析，是直观、敏感、快速、特异的诊断方法。但是，常用的双色单融合探针检测bcr/abl融合基因时，由于bcr和abl基因信号空间上的随机分布或光学重叠，可造成4％-10％的假阳性率。过高的假阳性率不仅影响到灵敏度与特异性，还可一定程度上影响研究者对实验结果的解释。(5)分子生物学检测，目前主要有两种PCR方法：一种为直接原位RT-PCR，这种方案更直接且容易实施，直接原位RT-PCR检测慢粒bcr/ablMrna具有特异性好，敏感度高，且无需提取RNA等优点。但由于引物错配和非特异性退火发生，容易产生非特异性结果；另一种为荧光定量PCR(qPCR)，PCR扩增时，加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，PCR扩增过程中，Taq酶的5’～3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而使荧光检测系统接受到荧光信号，每个模板的Ct值(即每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数)与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中纵坐标为起始拷贝数的对数，横坐标代表Ct值，然后根据待测样本的Ct值从标准曲线上计算出该样本的起始拷贝数，荧光定量PCR具有重复性好，特异性强等优点，但由于其依赖于Ct值，定量的准确度不够，且灵敏度比较差，目前该方法的灵敏度最好的为1％，无法满足某些高灵敏度的检测需求。根据白血病的缓解指标分类，“临床治愈”指白血病临床症状消失，BCR/ABL转录水平下降4个对数级以上，利用RT-PCR技术无法检测到体内bcr/abl转录本。但是由于RT-PCR检测技术限制(灵敏度最好的为1％)，即使无法检测出体内bcr/abl转录本的患者仍可能残留少量白血病细胞，这些残留白血病细胞仍存在复发的可能。因此需要一种检测限更低的技术，将患者的复发风险降到更低。
技术实现思路
为了克服现有技术的上述不足，本专利技术的目的是针对RT-PCR灵敏度低的缺陷，提出一种ddPCR技术检测BCR/ABL融合基因的引物及其检测方法，该引物和探针针对性强，同时引物的设计可同时实现3种型别的检测，本专利技术的ddPCR技术检测BCR/ABL融合基因方法灵敏度更高，并且避免假阴性结果。为了达到上述目的，本专利技术是通过以下技术方案实现的：本专利技术提供了ddPCR技术检测BCR/ABL融合基因的引物和探针，用于检测BCR/ABLP210融合基因的上游引物序列如SEQIDNO：1所示，用于检测BCR/ABLP190融合基因的上游引物序列如SEQIDNO：2所示，用于检测BCR/ABLP230融合基因的上游引物序列如SEQIDNO：3所示；用于检测BCR/ABLP210融合基因和BCR/ABLP190融合基因的下游引物序列如SEQIDNO：4所示，用于检测BCR/ABLP230融合基因的下游引物序列如SEQIDNO：5所示；BCR/ABL融合基因检测探针序列如SEQIDNO：6所示。进一步地，所述检测BCR/ABL融合基因探针为经过荧光标记的，其5’端标记有报告基团，3’端标记有非荧光淬灭基团。本专利技术还提供了一种基于ddPCR技术检测BCR/ABL融合基因的方法，其特征在于，包含以下步骤：1)提取受试者骨髓、外周血或组织的RNA提取；2)将步骤1)提取的RNA反转录成cDNA；3)以cDNA为模板，将待测样品cDNA模板、用于检测BCR/ABL融合基因上下游引物、BCR/ABL融合基因检测探针、内参基因的上下游引物、内参基因检测探针以及PCR预混液混合，制备ddPCR混合液；所述BCR/ABL融合基因包括BCR/ABLP210融合基因、BCR/ABLP190融合基因和BCR/ABLP230融合基因，用于检测BCR/ABLP210融合基因的上游引物序列如SEQIDNO：1所本文档来自技高网...

【技术保护点】
ddPCR技术检测BCR/ABL融合基因的引物和探针，其特征在于，用于检测BCR/ABL P210融合基因的上游引物序列如SEQ ID NO：1所示，用于检测BCR/ABL P190融合基因的上游引物序列如SEQ ID NO：2所示，用于检测BCR/ABL P230融合基因的上游引物序列如SEQ ID NO：3所示；用于检测BCR/ABLP210融合基因和BCR/ABL P190融合基因的下游引物序列如SEQ ID NO：4所示，用于检测BCR/ABLP230融合基因的下游引物序列如SEQ ID NO：5所示；BCR/ABL融合基因检测探针序列如SEQ ID NO：6所示。

【技术特征摘要】
1.ddPCR技术检测BCR/ABL融合基因的引物和探针，其特征在于，用于检测BCR/ABLP210融合基因的上游引物序列如SEQIDNO：1所示，用于检测BCR/ABLP190融合基因的上游引物序列如SEQIDNO：2所示，用于检测BCR/ABLP230融合基因的上游引物序列如SEQIDNO：3所示；用于检测BCR/ABLP210融合基因和BCR/ABLP190融合基因的下游引物序列如SEQIDNO：4所示，用于检测BCR/ABLP230融合基因的下游引物序列如SEQIDNO：5所示；BCR/ABL融合基因检测探针序列如SEQIDNO：6所示。2.根据权利要求1所述的ddPCR技术检测BCR/ABL融合基因的引物和探针，其特征在于，所述检测BCR/ABL融合基因探针为经过荧光标记的，其5’端标记有报告基团，3’端标记有非荧光淬灭基团。3.一种基于ddPCR技术检测BCR/ABL融合基因的方法，其特征在于，包含以下步骤：1)提取受试者骨髓、外周血或组织的RNA提取；2)将步骤1)提取的RNA反转录成cDNA；3)以cDNA为模板，将待测样品cDNA模板、用于检测BCR/ABL融合基因上下游引物、BCR/ABL融合基因检测探针、内参基因的上下游引物、内参基因检测探针以及PCR预混液混合，制备ddPCR混合液；所述BCR/ABL融合基因包括BCR/ABLP210融合基因、BCR/ABLP190融合基因和BCR/ABLP230融合基因，用于检测BCR/ABLP210融合基因的上游引物序列如SEQIDNO：1所示，用于检测BCR/ABLP190融合基因的上游引物序列如SEQIDNO：2所示，用于检测BCR/ABLP230融合基因的上游引物序列如SEQIDNO：3所示；用于检测BCR/ABLP210融合基因和BCR/ABLP190融合基因的下游引物序列如SEQIDNO：4所示，用于检测BCR/ABLP230融合基因的下游引物序列如SEQ...

【专利技术属性】
技术研发人员：王昕昀，
申请(专利权)人：良培基因生物科技武汉有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42