一种基于序列特异性核酸结合蛋白的核酸检测和分型的方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种基于序列特异性核酸结合蛋白的核酸检测和分型的方法及其应用，该方法通过将待检核酸与表面带有序列特异性核酸结合蛋白的微球混合或者将待检核酸、序列特异性核酸结合蛋白及微球混合，室温孵育，借助显微工具进行微球观测，即可完成核酸检测及分型。本发明专利技术的方法可在不经传统核酸检测中进行的核酸扩增、核酸杂交等复杂、耗时、费钱程序的情况下，快速、简单地实现低至飞摩级DNA分子的检测。本发明专利技术利用了序列特异性核酸结合蛋白对核酸分子的特异性识别和结合特性，成功避免了目前核酸检测和分型领域中核酸杂交和扩增等关键瓶颈问题，实现了可视化、数字化、超灵敏的核酸快速检测，在核酸检测领域具有极其广泛的巨大的应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种基于序列特异性核酸结合蛋白的核酸检测和分型的方法及其应用
本专利技术属于生物医学
，具体涉及涉及一种基于序列特异性核酸结合蛋白的核酸检测和分型的方法及其应用。
技术介绍
对于基础研究、各种检测及诊断应用，DNA检测和基因分型一直很重要。因此，DNA检测和基因分型技术一直受到广泛关注，从而促进了该类技术发展。归纳起来，主要有三类DNA检测和基因分型技术被广泛应用。第一种是基于聚合酶链反应(PCR)的各种技术。PCR是最常用的DNA检测和基因分型技术。基于PCR的DNA检测和基因分型主要依赖于特异性引物的设计和多重PCR扩增。PCR检测可以通过传统PCR(tPCR)，定量PCR(qPCR)和最近开发的数字PCR来实现。因为具有明显的优点，如实时检测和高灵敏度，Q-PCR在几乎所有的研究、检测和诊断实验室中得到高度普及。现在已经开发出更准确的数字PCR，作为临床检测工具，具有很大的潜力和优势。然而，PCR技术在用于区分高度相关的基因型时，要受到多重扩增和高度特异性引物的限制。除PCR技术外，DNA微阵列等多种DNA杂交技术也被广泛用于检测和分型DNA。然而，由于其昂贵的设备，复杂的检测流程和难以避免的非特异性杂交，DNA微阵列技术不能像PCR一样成为常规DNA检测和基因分型工具。DNA测序是另一种有效的DNA检测和基因分型技术。特别是随着下一代测序(NGS)技术的出现，诸如IlluminaNovaSeq等NGS平台的DNA测序工具越来越多。然而，由于需要昂贵的设备和化学试剂，它们仍然不能像PCR一样用于常规研究，检测和诊断。此外，近年来还开发出了各类核酸等温扩增技术用于核酸检测，如滚环扩增(RCA)、重组酶聚合酶扩增(RPA)、多重置换扩增(MDA)、环介导等温扩增技术(LAMP)、依赖核酸序列的扩增(NASBA)、解旋酶依赖扩增(HDA)、切刻酶扩增反应(NEAR)等，但这些检测技术都依赖形形色色的核酸扩增程序才能实现核酸的检测。因此，相比之下，如果克服了引物设计的限制，PCR仍然是最方便、经济高效的DNA检测和基因分型的平台。Ishino等人于1987年首先在大肠杆菌(E.coli)的基因组中发现了成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)，并由Jansen等人在2002年定义为CRISPR。现在，已知的CRISPR系统包括三种不同类型(类型I，II和III)。I型和III型系统由多种Cas蛋白组成，而II型系统只需要一种Cas蛋白Cas9。Cas9与CRISPR相关的RNA(crRNA)和反式激活的crRNA(tracrRNA)相关联。TracrRNA能够激活Cas9核酸酶，crRNA与目标DNA的20个核苷酸序列互补。因此后者决定了CRISPR-Cas9系统的特异性。crRNA引导的Cas9核酸酶可以与原始毗邻基序(PAM)相邻的靶DNA结合，并在PAM序列(NGG)上游三个碱基处切割靶DNA。将tracrRNA和crRNA整合成一个单导向RNA(sgRNA)后，极大地简化了II型CRISPR系统的应用。由sgRNA引导着Cas9去切割靶DNA。目前，CRISPR-Cas9系统由于其简便性和高效性，被许多研究者广泛应用于基因组编辑领域。另外，dCas9(deadCas9)是由Cas9改造而成，其失去了核酸酶活性，但保留基因转录激活结构域(AD)或抑制结构域(ID)，dCas9(deadCas9)作为一种新的人工转录因子已被广泛应用于内源性基因表达调控。尽管Cas9/sgRNA已广泛应用于基因编辑和调控，但目前还没有充分地探讨用于核酸检测领域。凭借高特异性的DNA识别及切割能力(能够区分单碱基)，Cas9/sgRNA及其他CRISPR相关核酸酶(如Cpf1等)在DNA检测和分型上有具有很大的潜力。最近，CRISPR-Cas9系统已被用于检测Zika病毒并且能够对美国和非洲Zika病毒进行分型。鉴于CRISPR的工具的高度特异性，CRISPR-Cas9在区分病毒株时可以达到单碱基的分辨率，可以在单碱基水平上对直系同源的细菌和病毒进行分型检测。最近CRISPR系统(III型的Cas13a/C2c2)已经应用于Zika病毒的检测并且具有超高灵敏度(病毒颗粒的量低至2aM。这些研究表明，CRISPR系统用于开发核酸检测技术时具有很大的潜力和优势。然而，在目前报道的基于Cas9的核酸检测方法中，他们是先用待检测RNA反转录出单链DNA，再生成双链DNA，然后用Cas9/sgRNA系统切割双链DNA来达到分型RNA的目的。因此，CRISPR系统，特别是Cas9/sgRNA系统目前尚未充分开发用于核酸的检测和分型。转录激活因子样效应物(transcriptionactivator-likeeffector，TALE)是CRISPR技术出现前使用的一种基因编辑工具。该种蛋白是一种典型的序列特异性DNA结合蛋白，可通过改变其重复单元中的两个关键氨基酸就可以构建靶向特定序列的TALE蛋白。TALE蛋白融合核酸内切酶如FolI后，则成为TALEN(transcriptionactivator-likeeffectornuclease)，是至今仍然在使用的基因编辑工具。TALE蛋白融合转录激活结构域(AD)或转录抑制结构域(ID)后，则成为TALE-TF(transcriptionactivator-likeeffector-transcriptionfactor)，是靶向调控细胞内特定基因表达的人造转录因子。TALE已经充分地开发用于基因编辑和基因调控，但极少报道用于核酸检测，其用于核酸检测的价值未被充分挖掘利用。
技术实现思路
专利技术目的：针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种基于序列特异性核酸结合蛋白(sequence-specificnucleicacid-bindingproteins，指这类蛋白可识别并结合特定序列的核酸)的核酸检测和分型的方法，简称为PABE方法，即“蛋白辅助的微球纠缠(Protein-AssistantBeadsEntanglement)”。该方法只经一个步骤即可完成核酸检测与分型，本专利技术开发的基于序列特异性核酸结合蛋白的核酸检测和分型的方法，可在不经传统核酸检测中进行的核酸扩增、核酸杂交等复杂、耗时、费钱程序的情况下，快速(数分钟)、简单(一步法)地实现低至飞摩(fM)级DNA分子的检测。本专利技术还提供基于序列特异性核酸结合蛋白的核酸检测和分型的方法的应用。技术方案：为了实现上述目的，如本专利技术所述的一种基于序列特异性核酸结合蛋白的核酸检测和分型的方法，包括如下步骤：将待检核酸与表面带有序列特异性核酸结合蛋白的微球混合或者将待检核酸、序列特异性核酸结合蛋白及微球混合，室温孵育数分钟，借助显微工具进行微球的观测，即可完成核酸检测及分型。其中，所述核酸包括核糖核酸(RNA)与脱氧核糖核酸(DNA)。其中，所述序列特异性核酸结合蛋白包括各种可序列特异性识别并结合核酸分子的蛋白或各种可序列特异性识别并结合核酸分子的蛋白复合物所述序列特异性识别并结合核酸分子的蛋白包括锌指蛋白(Zincfinger)、转录激活因子样效应物(transcriptionactivator-likeeffec本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于序列特异性核酸结合蛋白的核酸检测和分型的方法，其特征在于，包括如下步骤：将待检核酸与表面带有序列特异性核酸结合蛋白的微球混合或者将待检核酸、序列特异性核酸结合蛋白及微球混合，室温孵育，借助显微工具进行微球的观测，即可完成核酸检测及分型。

【技术特征摘要】
1.一种基于序列特异性核酸结合蛋白的核酸检测和分型的方法，其特征在于，包括如下步骤：将待检核酸与表面带有序列特异性核酸结合蛋白的微球混合或者将待检核酸、序列特异性核酸结合蛋白及微球混合，室温孵育，借助显微工具进行微球的观测，即可完成核酸检测及分型。2.根据权利要求1所述的核酸检测和分型的方法，其特征在于，所述序列特异性核酸结合蛋白包括各种可序列特异性识别并结合核酸分子的蛋白或各种可序列特异性识别并结合核酸分子的蛋白复合物。3.根据权利要求2所述的核酸检测和分型的方法，其特征在于，所述序列特异性识别并结合核酸分子的蛋白包括锌指蛋白、转录激活因子样效应物、CRISPR核酸酶、Ago蛋白、重组酶、限制性内切酶或转录因子；所述蛋白复合物为锌指蛋白、转录激活因子样效应物、CRISPR核酸酶、Ago蛋白、重组酶、限制性内切酶或转录因子的复合物。4.根据权利要求3所述的核酸检测和分型的方法，其特征在于，所述CRISPR核酸酶包括具有天然核酸切割活性的CRISPR核酸酶、人工改性后失去部分或全部核酸切割活性的CRISPR核酸酶。5.根据权利要求3所述的核酸检测和分型的方法，其特征在于，所述CRISPR核酸酶的复合物是指CRISPR核酸酶与其匹配的RNA结合形成的CRISPR核酸酶/RNA复合物，该类CRISPR核酸酶/RNA复合物可在RNA的引导下...

【专利技术属性】
技术研发人员：王进科，徐新慧，
申请(专利权)人：东南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32