牛双芽巴贝斯虫的Real-time PCR特异性引物和探针及检测试剂盒与检测方法技术

一种牛双芽巴贝斯虫的Real‑time PCR特异性引物和探针及检测试剂盒与检测方法，以双芽巴贝斯虫的18s rRNA基因作为目标基因，该序列高度保守，PCR容易扩增，根据TaqMan实时荧光PCR的基本原理，针对B.bigemina的18s rRNA为靶基因的特异性区域，结合其它巴贝斯虫18s rRNA基因的相关信息，设计2条特异性引物和1条探针，建立一种简便、高效、实用的DNA检测方法，单蜱虫甚至蜱虫的部分组织器官提取的微量基因组DNA即可作为模板进行鉴定，该方法可用于牛双芽巴贝斯虫病快速检测，应用前景广阔，可以准确、快速的判断牛是否感染了牛双芽巴贝斯虫。

Real-time PCR specific primers and probes, detection kit and detection method of bovine double bud BABEI worm

A Real time PCR specific primer and probe, detection kit and detection method for the bovine double bud PCR worm, and the detection method, using the 18S rRNA gene of the double buds of BABEI as the target gene, the sequence is highly conservative, and the PCR is easy to expand. According to the basic principle of TaqMan real-time fluorescent PCR, the target gene for B.bigemina 18S rRNA is the target gene. In the heterosexual region, 2 specific primers and 1 probes were designed to establish a simple, efficient and practical DNA detection method based on the related information of the other BABEI rRNA gene, and a simple, efficient and practical DNA detection method was established. The microgenomic DNA extracted from some ticks and even some ticks can be identified as a model plate. This method can be used for Niu Shuangya. The rapid detection of BABEI snail fever and its wide application prospect can accurately and quickly determine whether the cow infected with Niu Shuangya BABEI worm.

【技术实现步骤摘要】
牛双芽巴贝斯虫的Real-timePCR特异性引物和探针及检测试剂盒与检测方法
本专利技术具体涉及生物学
，具体涉及一种牛双芽巴贝斯虫的Real-timePCR特异性引物和探针及检测试剂盒与Real-timePCR检测方法。
技术介绍
牛双芽巴贝斯虫是一类经蜱传播，红细胞内寄生的血液原虫，由该类寄生虫引起的巴贝斯虫病，是一种急性过程的季节性疾病，在世界上许多地区发生和流行，我国各地也常有发生，给畜牧业和国民经济造成巨大损失。牛感染该虫后，常出现贫血、发热、血红蛋白尿、共济失调等症状，严重影响牛的健康。该病已经造成了巨大的经济损失，并呈世界范围扩大趋势，因而引起国内外学者的广泛关注。牛双芽巴贝斯虫是经蜱传播的一种血液原虫，寄生于哺乳动物红细胞、淋巴细胞和其他细胞中，也可以寄生在蜱的各种组织细胞中。双芽巴贝斯虫寄生于黄牛、奶牛、水牛和瘤牛的红细胞内，由微小牛蜱(Boop-hilusmicroplus)、无色牛蜱(B.decoloratus)、环形牛蜱(B.annulatus)等多种蜱，经卵传播。双芽巴贝斯虫的临床诊断最基本的方法是血液涂片镜检，但是该方法只能用于对发病牛的检测，但对疫病普查和进出口检疫则有困难，因为发病牛只痊愈后很难查到虫体。血清学检查也是牛双芽巴贝斯虫流行病学研究行之有效的方法，但是该类方法不能区别动物是正处于感染中还是已经感染耐过，不能鉴定带虫动物以及贮存宿主。敏感性更高的方法，例如常规PCR检测技术也是诊断寄生在蜱体内的巴贝斯虫最常用的方法，但是该方法具有很大的一个缺点-低特异性，扩增时容易产生假阳性。而且在检测牛双芽巴贝斯虫的过程中发现，牛双芽巴贝斯虫与牛巴贝斯虫之间常出现交叉反应。敏感性和特异性更高的方法，例如反向线性斑点杂交技术(RBL)以及PCR-ELISA等也已经见诸于报道，但是这些方法都存在假阳性率高的缺点。Real-timePCR是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号实时监测整个PCR过程，与常规PCR相比，具有特异性更强、敏感性更高、有效解决PCR污染、自动化程度高等特点。因其需要的取样量少、快速简便等优点，实时荧光PCR检测技术已广泛应用于病原体检测。
技术实现思路
为了解决现有技术的缺陷及不足，本专利技术提供了一种牛双芽巴贝斯虫的TaqMan-BHQReal-timePCR特异性引物和探针及检测试剂盒与TaqMan-BHQReal-timePCR检测方法，建立一种简便、高效、实用的DNA检测方法。该方法可用于牛双芽巴贝斯虫病快速检测，应用前景广阔。本专利技术采用的技术解决方案是：一种牛双芽巴贝斯虫的TaqMan-BHQReal-timePCR特异性引物和探针，包括设计的引物F、引物R和探针P，所述的引物F、引物R和探针P分别是按下述碱基序列由DNA合成仪合成DNA片段，具体为：引物F：5′-TCA-GCG-ACT-ACG-TCC-ATT-TG-C-3′；引物R：5′-AAT-CAA-CTT-GGC-AGG-GTC-AT-3′`；探针P：5＇-HEX-CCG-CGT-ACA-AGA-GGT-GAT-ACA-GGA-A-BHQ-3′。一种牛双芽巴贝斯虫的TaqMan-BHQReal-timePCR检测试剂盒，所述的TaqMan-BHQReal-timePCR检测试剂盒包括以下组分：(一)Real-timePCR预混液：主要成分为2×TaqManUniversalMasterMix；(二)权利要求1所述的引物F、引物R和探针P；(三)阳性对照：所述的阳性对照为该对照为含有目的基因片段的重组质粒，该质粒含牛双芽巴贝斯虫798bp基因片段；(四)阴性对照：所述的阴性对照为去离子水；所述的阳性对照通过将扩增产物克隆至pUCm-T转化DH5-α感受态细胞，经酶切鉴定及测序后获得阳性重组质粒。一种采用所述的特异性引物和探针的牛双芽巴贝斯虫的TaqMan-BHQReal-timePCR检测方法，包括以下步骤：(1)被检标本DNA提取：取微小牛蜱数只，75％的酒精清洗，每只微小牛蜱放入单独的1.5mlEPdof管，200μLPBS液浸没蜱，用样品破碎仪破碎蜱的虫体，吸取破碎后的溶液，加入Trizol试剂裂解，采用常规的酚/氯仿抽提，乙醇沉淀，干燥后用三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸溶解，-20℃保存备用；(2)以特异性引物和探针进行Real-timePCR反应操作：将2×TaqManUniversalMasterMix12.5μL，25pmol/μL的引物F1.0μL；25pmol/μL的引物R1.0μL；12.5pmol/μL的探针P1.0μL；DNA模板2.0μL；ddH2O7.5μL，混匀后稍离心在25μL反应体系中进行荧光PCR反应操作；(3)pUC-18srRNA质粒Real-timePCR标准曲线制作：测定质粒D260nm值和D280nm值，用D260nm/D280nm值为1.8～2.0的质粒用于制作标准曲线；(4)检测微小牛蜱传带的牛双芽巴贝斯虫18srRNA基因：运行本专利技术中的反应参数，检出微小牛蜱DNA中含有牛双芽巴贝斯虫18srRNA基因，通过计算机利用分析软件得到Real-timePCR扩增曲线，与阳性对照的扩增曲线比对，判断是否存在牛双芽巴贝斯虫18srRNA基因。所述的反应参数为UNG酶消除残留污染处理为50℃，15mins；预变性处理为95℃，2mins；50个循环：变性处理95℃，10s，退火/延伸/收集荧光信号处理60℃，60s。本专利技术的有益效果是：本专利技术提供了一种牛双芽巴贝斯虫的Real-timePCR特异性引物和探针及检测试剂盒与TaqMan-BHQReal-timePCR检测方法，具体为一种牛双芽巴贝斯虫的TaqMan-BHQReal-timePCR特异性引物和探针及检测试剂盒与TaqMan-BHQReal-timePCR检测方法，以双芽巴贝斯虫的18srRNA基因作为目标基因，该序列高度保守，PCR容易扩增，GenBank数据库中相关序列信息丰富，根据TaqMan实时荧光PCR的基本原理，针对B.bigemina的18srRNA为靶基因的特异性区域，结合其它巴贝斯虫18srRNA基因的相关信息，设计2条特异性引物和1条探针，建立一种简便、高效、实用的DNA检测方法，单蜱虫甚至蜱虫的部分组织器官提取的微量基因组DNA即可作为模板进行鉴定，该方法可用于牛双芽巴贝斯虫病快速检测，应用前景广阔，可以准确、快速的判断牛是否感染了牛双芽巴贝斯虫。附图说明图1为本专利技术方法对B.bigeminapUC-18srRNA质粒进行Real-timePCR敏感性检测的扩增曲线图；其中1为pUC-18srRNA质粒标准品浓度2X105拷贝/μL；2为pUC-18srRNA质粒标准品浓度2X104拷贝/μL；3为pUC-18srRNA质粒标准品浓度2X103拷贝/μL；4为pUC-18srRNA质粒标准品浓度2X102拷贝/μL；5为pUC-18srRNA质粒标准品浓度2X101拷贝/μL；6为pUC-18srRNA质粒标准品浓度2X100拷贝/μL；7为阴性对照。图2为B.bigeminapUC-18srRNA质粒常规PCR的敏感性检测凝胶电泳图；其中1为pU本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种牛双芽巴贝斯虫的Real‑time PCR特异性引物和探针，其特征在于，包括设计的引物F、引物R和探针P，所述的引物F、引物R和探针P分别是按下述碱基序列由DNA合成仪合成DNA片段，具体为：引物F：5′‑TCA‑GCG‑ACT‑ACG‑TCC‑ATT‑TG‑C‑3′；引物R：5′‑AAT‑CAA‑CTT‑GGC‑AGG‑GTC‑AT‑3′`；探针P：5′‑HEX‑CCG‑CGT‑ACA‑AGA‑GGT‑GAT‑ACA‑GGA‑A‑BHQ‑3′。

【技术特征摘要】
1.一种牛双芽巴贝斯虫的Real-timePCR特异性引物和探针，其特征在于，包括设计的引物F、引物R和探针P，所述的引物F、引物R和探针P分别是按下述碱基序列由DNA合成仪合成DNA片段，具体为：引物F：5′-TCA-GCG-ACT-ACG-TCC-ATT-TG-C-3′；引物R：5′-AAT-CAA-CTT-GGC-AGG-GTC-AT-3′`；探针P：5′-HEX-CCG-CGT-ACA-AGA-GGT-GAT-ACA-GGA-A-BHQ-3′。2.一种牛双芽巴贝斯虫的Real-timePCR检测试剂盒，其特征在于，所述的Real-timePCR检测试剂盒包括以下组分：(一)Real-timePCR反应液：主要成分为2×TaqManUniversalMasterMix；(二)权利要求1所述的引物F、引物R和探针P；(三)阳性对照：所述的阳性对照为该对照为含有目的基因片段的重组质粒，该质粒含牛双芽巴贝斯虫798bp基因片段；(四)阴性对照：所述的阴性对照为去离子水。3.根据权利要求2所述的牛双芽巴贝斯虫的Real-timePCR检测试剂盒，其特征在于，所述的阳性对照通过将扩增产物克隆至pUCm-T转化DH5-α感受态细胞，经酶切鉴定及测序后获得阳性重组质粒。4.一种采用权利要求1所述的特异性引物和探针的牛双芽巴贝斯虫的Real-timePCR检测方法，其特征在于以下实验步骤：(1)被检标本DNA提取：取微小牛蜱数只，75％的酒精清洗，每只微小牛蜱放入单独的1.5mlEPdof管，200μLPB...

【专利技术属性】
技术研发人员：王素华，帅江冰，张晓峰，吕继洲，吴绍强，袁淑辉，
申请(专利权)人：王素华，
类型：发明
国别省市：浙江,33