一种纯化蛋白的方法技术

本发明专利技术提供了一种纯化蛋白的方法,上述方法包括如下步骤:1)选择S100蛋白家族构建待纯化蛋白的重组融合蛋白表达载体；2)上述重组融合蛋白的表达:得到表达菌体；3)上述重组融合蛋白的分离纯化:收集上述表达菌体，破碎上述表达菌体的细胞，离心并收集含上述重组融合蛋白的上清液,上述上清液进行阴离子交换柱初步分离,经过上样、洗脱并收集混合在300至400毫升范围内的洗脱液样品,向上述洗脱液样品中加入氯化钙(CaCl2),上疏水层析柱，得到上述疏水层析柱纯化后的融合蛋白；4)电泳鉴定；5)酶切纯化上述疏水层析柱纯化后的融合蛋白。本发明专利技术提出的新的纯化蛋白的方法，操作方便，成本低，纯化效果好。

A method for purifying protein

The present invention provides a method for purifying protein. The method includes the following steps: 1) select the S100 protein family to construct the recombinant fusion protein expression vector of the purified protein; 2) the expression of the recombinant fusion protein: the expression of the bacteria; 3) the separation and purification of the above recombinant fusion protein: collect the above expressed bacteria and break the above table The cells of the mycelium were centrifuged and collected from the supernatant containing the recombinant fusion protein. The above supernatant was preliminarily separated by the anion exchange column. The eluate samples were collected, eluted and collected in the range of 300 to 400 milliliters. The above eluant samples were added to the above eluent samples by adding calcium chloride (CaCl2) to the hydrophobic column to get the above hydrophobicity. The purified fusion protein was purified by column chromatography; 4) electrophoresis was identified; 5) the purified fusion protein purified by hydrophobic chromatography column was purified by enzyme digestion. The method of purifying new protein proposed by the invention is convenient to operate, low in cost and good in purification effect.

【技术实现步骤摘要】
一种纯化蛋白的方法
本专利技术涉及生物医药领域，更具体地，涉及一种纯化蛋白的方法。
技术介绍
对于纯化分子量小于60千道尔顿(kDa)的蛋白，现有技术采用的方法是电泳、离子交换、蛋白沉淀、亲和层析等，但这些纯化方法单一使用各有缺陷，比如蛋白沉淀纯化效果差；电泳的分离效果好，但制备量太低，不适用于大规模制备；离子交换：即便是用最精确控制的条件，仅用离子交换单一的方法也得不到纯的蛋白，还需要其他的纯化步骤；亲和层析：单抗非常昂贵，而且也需先纯化，单抗与目的蛋白结合力太强.要用苛刻的条件来洗脱，这会使目的蛋白失活并破坏单抗，混合物中的其他蛋白如蛋白酶也可能破坏抗体或与它们非特异结合，某些单抗也会在纯化过程中从树脂上解离下来混入产物中，也需要从终产物中去除。即便是这些方法和其他方法配合使用，也很难得到纯化度很高的蛋白，并且操作复杂，现有技术中纯化蛋白较好的蛋白纯化仪(AKTA)价格太昂贵，故有待提出一个新的操作方便成本低的纯化蛋白的方法。
技术实现思路
本专利技术提供了一种纯化蛋白的方法，以至少解决现有技术中纯化蛋白的方法操作复杂成本高的技术问题。本专利技术提供了一种纯化蛋白的方法,上述方法包括本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种纯化蛋白的方法,其特征在于:所述方法包括如下步骤:1)选择S100蛋白家族构建待纯化蛋白的重组融合蛋白表达载体；2)所述重组融合蛋白的表达:得到表达菌体；3)所述重组融合蛋白的分离纯化:收集所述表达菌体，破碎所述表达菌体的细胞，离心并收集含所述重组融合蛋白的上清液,所述上清液进行阴离子交换柱初步分离,经过上样、洗脱并收集混合在300至400毫升范围内的洗脱液样品,向所述洗脱液样品中加入氯化钙(CaCl2),上疏水层析柱，得到所述疏水层析柱纯化后的融合蛋白；4)电泳鉴定；5)酶切纯化所述疏水层析柱纯化后的融合蛋白。

【技术特征摘要】
1.一种纯化蛋白的方法,其特征在于:所述方法包括如下步骤:1)选择S100蛋白家族构建待纯化蛋白的重组融合蛋白表达载体；2)所述重组融合蛋白的表达:得到表达菌体；3)所述重组融合蛋白的分离纯化:收集所述表达菌体，破碎所述表达菌体的细胞，离心并收集含所述重组融合蛋白的上清液,所述上清液进行阴离子交换柱初步分离,经过上样、洗脱并收集混合在300至400毫升范围内的洗脱液样品,向所述洗脱液样品中加入氯化钙(CaCl2),上疏水层析柱，得到所述疏水层析柱纯化后的融合蛋白；4)电泳鉴定；5)酶切纯化所述疏水层析柱纯化后的融合蛋白。2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:满足下列中的一项或几项：所述步骤1)中选择载体pET32a构建所述待纯化蛋白的重组融合蛋白表达载体，所述载体含有NdeI和HindIII酶切识别位点，鉴定所述重组融合蛋白的重组融合基因序列,获得阳性的重组表达载体；和/或所述步骤3)中，所述上清液上DEAE-琼脂糖凝胶FF(DEAE-sephroseFF)阴离子交换柱进行初步的分离,所述上样的缓冲液是25毫摩尔/升三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)，pH为7.5，100毫摩尔/升氯化钠(NaCl)，所述洗脱的缓冲液是25毫摩尔/升三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)，pH为7.5，1摩尔/升氯化钠(NaCl)；向所述样品中加入5毫摩尔/升氯化钙(CaCl2),水系滤器过滤,过滤后的所述样品上疏水层析柱，加入所述上疏水层析柱的平衡缓冲液三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)，所述上疏水层析柱的洗脱缓冲液是三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)和乙二醇双-2-氨基乙基醚-四乙酸(EGTA)；和/或所述步骤4)中所述电泳鉴定包括的步骤是电泳凝胶、点样、染色、脱色液脱色、所述脱色期间更换2至4次所述脱色液，得到脱色后的凝胶，最后将所述脱色后的凝胶浸泡于水中；和/或所述步骤5)中所述酶切纯化所述融合蛋白的条件为:酶切体系为15至25毫摩尔/升磷酸缓冲液，pH为7至8,酶切温度为35至37摄氏度,酶切时间为15至17小时,以所述融合蛋白3至5毫克/U(mg/U)肠激酶(EK)为基准做加酶量。3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于:所述步骤2)中所述重组融合蛋白的表达是将所述阳性的重组表达载体转入BL21感受态细胞中，于含氨苄青霉素的液体LB培养基...

【专利技术属性】
技术研发人员：王天泽，郝淑静，
申请(专利权)人：北京中科唯新生物医学研究所有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11