用于检测血清中HuA21抗体的ELISA检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种用于检测血清中HuA21抗体的ELISA检测试剂盒。该试剂盒包括标准抗原、捕获抗体和检测抗体；所述标准抗原为人源化HuA21抗体；所述捕获抗体为抗人源化HuA21抗体的抗体1A4，所述检测抗体为经生物素标记的抗人源化HuA21抗体的抗体1C9。本发明专利技术所提供的基于双抗体夹心法检测血清中人源化HuA21抗体含量的酶联免疫(ELISA)试剂盒可实现对血清中人源化HuA21抗体含量的准确定量检测，且稳定性好，操作简便，费用也较传统检测方法低廉。因此具有重要的应用价值。

ELISA detection kit for detection of serum HuA21 antibody in serum

The present invention discloses a ELISA detection kit for detecting HuA21 antibody in serum. The kit includes standard antigen, capture antibody and detection antibody. The standard antigen is humanized HuA21 antibody, and the capture antibody is antibody 1A4 against human derived HuA21 antibody. The detection antibody is antibody 1C9 of biotinylated anti human HuA21 antibody. The invention provides a double antibody sandwich method in detection of serum humanized HuA21 antibody levels of the enzyme based on immunoassay (ELISA) kit can achieve accurate quantitative detection of serum humanized HuA21 antibody content, and good stability, simple operation, low cost compared with the traditional detection method. Therefore, it has important application value.

【技术实现步骤摘要】
用于检测血清中HuA21抗体的ELISA检测试剂盒
本专利技术属于生物医药和
，具体涉及一种用于检测血清中HuA21抗体的ELISA检测试剂盒。
技术介绍
HuA21抗体(中国专利号ZL201410489895.X)是一种高亲和力的全人源化的单克隆抗体，能特异性识别并结合人肿瘤细胞表面HER2抗原，从而使HER2高表达的乳腺癌细胞增殖生长受到抑制。实验结果表明，相对于已经上市的曲妥珠单抗(商品名Herceptin，英文名Trastuzumab/Herceptin)，美国Genetech公司首先开发的抗HER2人源化单克隆抗体药物，HuA21抗体能够引起更强的抗原内吞作用，尤其是在Herceptin耐药性的细胞株中，例如Herceptin耐药性的BT474乳腺癌细胞株中，因此HuA21在抗体靶向药物(比如抗体-化药偶联物ADC)的开发中具有很好的应用前景。不仅如此，HuA21还能抑制HER2的磷酸化，而HER2的磷酸化是HER2活化所必须的，进而抑制HER2下游MAPK,PI3K-Akt信号通路，这一现象在HuA21与Herceptin联用更加明显。而且，HuA21与Herceptin联用能够显著抑制机体肿瘤的发展，这一结果在体内实验和体外实验都得到了证实。因此，HuA21在HER2高表达肿瘤例如乳腺癌的治疗方面具有巨大的应用潜力。无论是在临床前研究的药理学评价阶段，对抗体药物的药代动力学进行研究，还是在临床阶段以及再后来的治疗阶段，确定药物的治疗窗浓度对患者合理给药等，准确评估HuA21在生物体血液中的浓度都具有极其重要的意义。传统的测量血药浓度的方法主要有气相色谱法(GC)、气相-质谱联用法(GC-MS)、高效液相色谱-质谱联用法(HPLC-MS)等等。但是这些方法普遍价格高昂，而且需要专业的设备操作人员，分析时间也比较长，难以在临床上开展。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供了一种准确、高效、经济的用于检测血清中HuA21抗体的ELISA检测试剂盒。本专利技术所提供的用于检测血清中HuA21抗体含量的酶联免疫试剂盒，具体可包括标准抗原、捕获抗体和检测抗体；所述标准抗原为人源化HuA21抗体(中国专利号ZL201410489895.X)；所述捕获抗体为抗人源化HuA21抗体的抗体1A4(作为包被原)，所述检测抗体为经生物素标记的抗人源化HuA21抗体的抗体1C9。在所述试剂盒中，所述抗人源化HuA21抗体的抗体1A4的重链的氨基酸序列具体如SEQIDNo.1所示；所述抗人源化HuA21抗体的抗体1A4的轻链的氨基酸序列具体如SEQIDNo.2所示。在所述试剂盒中，所述抗人源化HuA21抗体的抗体1C9的重链的氨基酸序列具体如SEQIDNo.3所示；所述抗人源化HuA21抗体的抗体1C9的轻链的氨基酸序列具体如SEQIDNo.4所示。进一步地，所述抗人源化HuA21抗体的抗体1A4是通过将核苷酸序列如SEQIDNo.5所示的抗人源化HuA21抗体的抗体1A4的重链的编码基因和核苷酸序列如SEQIDNo.6所示的抗人源化HuA21抗体的抗体1A4的轻链的编码基因在受体细胞中进行表达得到的。其中，重链编码基因和轻链编码基因可为等摩尔使用。进一步地，所述抗人源化HuA21抗体的抗体1C9是通过将核苷酸序列如SEQIDNo.7所示的抗人源化HuA21抗体的抗体1C9的重链的编码基因和核苷酸序列如SEQIDNo.8所示的抗人源化HuA21抗体的抗体1C9的轻链的编码基因在受体细胞中进行表达得到的。其中，重链编码基因和轻链编码基因可为等摩尔使用。更进一步的，所述抗人源化HuA21抗体的抗体1A4的重链的编码基因是通过重组表达载体A导入所述受体细胞获得的。所述重组表达载体A具体是将SEQIDNo.5所示的DNA片段插入到pcDNA3.4(Life公司)载体的酶切位点BsrGI和HindIII之间后得到的重组质粒(命名为pcDNA3.4-1A4-1)。所述抗人源化HuA21抗体的抗体1A4的轻链的编码基因是通过重组表达载体B导入所述受体细胞获得的。所述重组表达载体B具体是将SEQIDNo.6所示的DNA片段插入到pcDNA3.4(Life公司)载体中的酶切位点XbaI和HindIII之间后得到的重组质粒(命名为pcDNA3.4-1A4-2)。更进一步的，所述抗人源化HuA21抗体的抗体1C9的重链的编码基因是通过重组表达载体C导入所述受体细胞获得的。所述重组表达载体C具体是将SEQIDNo.7所示的DNA片段插入到pcDNA3.4(Life公司)载体的酶切位点BsrGI和HindIII之间后得到的重组质粒(命名为pcDNA3.4-1C9-1)。所述抗人源化HuA21抗体的抗体1C9的轻链的编码基因是通过重组表达载体D导入所述受体细胞获得的。所述重组表达载体D具体是将SEQIDNo.8所示的DNA片段插入到pcDNA3.4(Life公司)载体中的酶切位点XbaI和HindIII之间后得到的重组质粒(命名为pcDNA3.4-1C9-2)。更加具体的，所述抗人源化HuA21抗体的抗体1A4是通过包括如下步骤的方法制备的：(1)将所述抗人源化HuA21抗体的抗体1A4的重链的编码基因(SEQIDNo.5)和所述抗人源化HuA21抗体的抗体1A4的轻链的编码基因(SEQIDNo.6)分别克隆到pcDNA3.4载体中后得到的两个重组质粒；(2)将步骤(1)所得的两个重组质粒共转染所述受体细胞，得到重组细胞，培养所述重组细胞，获得所述抗人源化HuA21抗体的抗体1A4。所述方法中，可以用亲和层析的方法对所述抗人源化HuA21抗体的抗体1A4进行分离和纯化，利用此方法可以将所述抗人源化HuA21抗体的抗体1A4纯化为基本均一的物质，例如在SDS-PAGE电泳上为单一条带。更加具体的，所述抗人源化HuA21抗体的抗体1C9是通过包括如下步骤的方法制备的：(1)将所述抗人源化HuA21抗体的抗体1C9的重链的编码基因(SEQIDNo.7)和所述抗人源化HuA21抗体的抗体1C9的轻链的编码基因(SEQIDNo.8)分别克隆到pcDNA3.4载体中后得到的两个重组质粒；(2)将步骤(1)所得的两个重组质粒共转染所述受体细胞，得到重组细胞，培养所述重组细胞，获得所述抗人源化HuA21抗体的抗体1C9。所述方法中，可以用亲和层析的方法对所述抗人源化HuA21抗体的抗体1C9进行分离和纯化，利用此方法可以将所述抗人源化HuA21抗体的抗体1C9纯化为基本均一的物质，例如在SDS-PAGE电泳上为单一条带。其中，所述受体细胞可为哺乳动物细胞或者昆虫细胞。在本专利技术中，所述受体细胞具体为哺乳动物细胞，更加具体的，为人肾上皮细胞系HEK293F。在本专利技术中，所述检测抗体具体按照包括如下步骤的方法制备获得的：将所述抗人源化HuA21抗体的抗体1C9与活化的生物素按照摩尔比1：30混合，室温(20-25℃)放置半小时，随后过分子筛柱去除未结合的生物素，得到经生物素标记的抗人源化HuA21抗体的抗体1C9即为所述检测抗体。除了上述物质，所述酶联免疫试剂盒中还可含有如下中的至少一种：酶标板(如96孔酶标板)、辣根过氧化物酶标记亲和素、铺板缓冲液本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测血清中HuA21抗体含量的酶联免疫试剂盒，包括标准抗原、捕获抗体和检测抗体；所述标准抗原为人源化HuA21抗体；所述捕获抗体为抗人源化HuA21抗体的抗体1A4，所述检测抗体为经生物素标记的抗人源化HuA21抗体的抗体1C9。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测血清中HuA21抗体含量的酶联免疫试剂盒，包括标准抗原、捕获抗体和检测抗体；所述标准抗原为人源化HuA21抗体；所述捕获抗体为抗人源化HuA21抗体的抗体1A4，所述检测抗体为经生物素标记的抗人源化HuA21抗体的抗体1C9。2.根据权利要求1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述抗人源化HuA21抗体的抗体1A4的重链的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示；所述抗人源化HuA21抗体的抗体1A4的轻链的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示；和/或所述抗人源化HuA21抗体的抗体1C9的重链的氨基酸序列如SEQIDNo.3所示；所述抗人源化HuA21抗体的抗体1C9的轻链的氨基酸序列如SEQIDNo.4所示。3.根据权利要求1或2所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述抗人源化HuA21抗体的抗体1A4是通过将核苷酸序列如SEQIDNo.5所示的抗人源化HuA21抗体的抗体1A4的重链的编码基因和核苷酸序列如SEQIDNo.6所示的抗人源化HuA21抗体的抗体1A4的轻链的编码基因在受体细胞中进行表达得到的；和/或所述抗人源化HuA21抗体的抗体1C9是通过将核苷酸序列如SEQIDNo.7所示的抗人源化HuA21抗体的抗体1C9的重链的编码基因和核苷酸序列如SEQIDNo.8所示的抗人源化HuA21抗体的抗体1C9的轻链的编码基因在受体细胞中进行表达得到的。4.根据权利要求1-3中任一所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述酶联免疫试剂盒中还含有如下中的至少一种：酶标板、辣根过氧化物酶标记的亲和素、铺板缓冲液、洗涤液、封闭液、显色液和终...

【专利技术属性】
技术研发人员：程联胜，娄阳，赵群，王凤荣，
申请(专利权)人：合肥瀚科迈博生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽,34