新型γδT细胞在制备评估AML疗效试剂盒中的应用制造技术

本发明专利技术提供了新型γδT细胞亚群在制备预测AML疗效及预后试剂盒中的应用；是基于本发明专利技术的发明专利技术人首次发现AML患者外周血中新型的γδT细胞亚群，其表达情况与AML患者的疗效和预后相关。当新型的PD1+Foxp3+γδT细胞亚群表达比例高时，表明AML患者临床疗效差的可能性较大。新型的γδT细胞亚群表达比例对于AML患者的预后判断和临床治疗方案的制定具有重要的指导意义，本发明专利技术可为AML患者的个体化治疗提供更多的基础研究资料，在预测AML患者临床疗效和预后评价方面具有广阔的应用前景。

Application of a new type of gamma delta T cell in the preparation of AML therapeutic Kit

The invention provides the application of new gamma delta T cell subsets in the preparation of predictive AML curative effect and prognosis kit. Based on the inventor of the invention, the new gamma delta T cell subgroup in the peripheral blood of AML patients is first discovered, and its expression is related to the curative effect and prognosis of AML patients. When the expression of a new PD1+Foxp3+ - Y - Delta T cell subgroup is high, the possibility of poor clinical efficacy of AML patients is more likely. New type of gamma delta T cell subsets expression ratio has an important guiding significance for the development and prognosis of AML patients in clinical treatment, the invention can provide more experimental data for AML patients with individualized treatment in the prediction and evaluation of clinical efficacy and prognosis of patients with AML and has broad application prospects.

【技术实现步骤摘要】
新型γδT细胞在制备评估AML疗效试剂盒中的应用
本专利技术属于生物医学领域，特别涉及新型γδT细胞亚群在制备预测AML疗效及预后试剂盒中的应用。
技术介绍
急性髓性白血病(acutemyeloidleukemia，AML)是一组起源于造血干细胞的恶性克隆性疾病，具有高度异质性，白血病细胞由于失去分化成熟的能力而停滞于细胞发育的不同阶段，并在骨髓及其他造血组织中大量聚积，使正常造血发生障碍，是成人中最为常见的白血病类型。目前对于AML的治疗主要包括诱导治疗和巩固治疗，近30年来，虽然AML的治疗取得了一定的疗效，对于某些伴有不良染色体或基因异常改变的AML患者由于无法彻底清除体内的白血病细胞，仍面临着缓解后复发或耐药。目前对于难治复发的AML患者来说，尚无高效的治疗方法，因此新的治疗策略有待于进一步提出，以清除患者微小残留病灶，延长患者生命，提高其生存质量。目前的研究显示，T细胞过继性免疫治疗针对AML患者展现出良好的应用前景。人类外周血T细胞根据所含肽链的不同，可分为αβT细胞和γδT细胞两个亚群。γδT细胞仅占人类外周血T细胞的1～10％，具有非主要组织相容性复合物(majorhistocompatibilitycomplex，MHC)限制性识别抗原的特性。近年来越来越多的研究表明γδT细胞具有多种多样的生物学功能，在宿主对外抗感染，抗肿瘤免疫，对内进行免疫监视、免疫防御、移植免疫及自身免疫病等多方面都发挥着重要作用。随着对γδT细胞研究的逐步深入，人们发现其不仅具有激活免疫反应的强大作用，在特定的条件下，同时也具有免疫调节功能。传统的调节性T细胞(regulatoryTcells，Treg)是一类具有免疫抑制性及免疫无能性的T细胞，在维持自身稳态方面有重要作用；研究表明在某些疾病状态下，其细胞数量的降低或增高可能参与了疾病的发生发展。调节性γδT细胞(regulatoryγδTcells，γδTreg)是近年来新发现的γδT细胞中的一种特殊亚群，表达特异性胞内转录因子叉头翼状螺旋家族转录抑制物p3(forkheadwinged-helixfamilytranscriptionalrepressor，Foxp3)。本专利技术的专利技术人在前期的研究中证实(专利申请号为CN201610752852.5的专利文献)，AML初发患者外周血γδT细胞的T细胞受体(Tcellreceptor，TCR)谱系分布及克隆增殖情况均发生了不同程度的改变，其不同亚群所执行的可能不尽相同。目前尚没有与γδT细胞亚群相关的有效预测AML患者临床疗效及状态评价的实验室指标；业界也没有对AML患者中PD-1信号通路途径是否参与调控γδTreg细胞进行探讨研究。本专利技术正是基于目前存在的技术问题而提出的新的解决方案。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供新型γδT细胞亚群在制备用于预测AML疗效及预后评估试剂盒中的应用。本专利技术的另一目的在于提供一种预测AML疗效及预后评估的试剂盒。本专利技术的再一目的在于提供一种用于预测AML疗效及预后评估的γδT细胞亚群的检测方法。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：新型γδT细胞亚群在制备用于预测AML疗效及预后评估试剂盒中的应用，是基于本专利技术的专利技术人首次发现AML患者外周血中新型的γδT细胞亚群表达情况与AML患者的疗效和预后相关。所述的γδT细胞亚群包括Foxp3+γδT细胞、PD-1+γδT细胞和PD1+Foxp3+γδT细胞中的一种或至少两种。当所述的PD1+Foxp3+γδT细胞表达比例高时，表明AML患者临床疗效差的可能性较大。所述的PD1+Foxp3+γδT细胞表达比例高具体指：①当PD1+Foxp3+γδT细胞在总γδT细胞中所占比例的中位数为1.36％，AML患病的可能性较大；②当PD1+Foxp3+γδT细胞在总γδT细胞中所占比例的中位数为0.32％；AML缓解的可能性较大；③当PD1+Foxp3+γδT细胞在总γδT细胞中所占比例的中位数为0.1％时，为非AML疾病状态的可能性较大。所述的AML患病包括AML初发、AML预后不良或AML复发。一种预测AML疗效及预后评估的试剂盒，包括如下不同的荧光标记的单克隆抗体：抗CD45抗体、抗CD3抗体、抗TCRγδ抗体、抗PD-1抗体、所述的抗PD-1抗体的同型对照抗体和抗Foxp3抗体。所述的抗CD45抗体的荧光标记优选为V450。所述的抗CD3抗体的荧光标记优选为AlexaFluor700。所述的抗TCRγδ抗体的荧光标记优选为PE/Cy7。所述的抗PD-1抗体或所述的抗PD-1抗体的同型对照抗体的荧光标记优选为PE。所述的抗Foxp3抗体的荧光标记优选为AlexaFluor647。所述的试剂盒还包括所述的单克隆抗体各自对应的同型对照抗体。所述的试剂盒还包括用于细胞染色破膜的试剂、用于分离外周血单个核细胞的试剂和磷酸盐缓冲溶液(PBS)中的一种或至少两种。所述用于细胞染色破膜的试剂包括细胞染色缓冲液、固定/破膜缓冲液、破膜缓冲液中的一种或至少两种。所述的固定/破膜缓冲液优选为Foxp3固定/破膜缓冲液；所述的破膜缓冲液优选为Foxp3破膜缓冲液。所述的用于分离外周血单个核细胞的试剂优选为淋巴细胞分离液(Ficoll)。一种用于预测AML疗效及预后评估的γδT细胞亚群的检测方法，包括如下步骤：(1)处理待测外周血样本，形成单细胞悬液；具体来说，将待测外周血依据常规方法处理，分离得到淋巴细胞悬液；(2)在步骤(1)得到的单细胞悬液中加入标记不同荧光的单克隆抗体：抗CD45抗体、抗CD3抗体、抗TCRγδ抗体、抗PD-1抗体、所述的抗PD-1抗体的同型对照抗体，轻轻混匀后避光孵育；(3)洗涤细胞后加入固定/破膜缓冲液，避光孵育，再次洗涤细胞，充分混匀后，离心去上清；(4)洗涤细胞，加入破膜缓冲液重悬细胞避光孵育；(5)离心去上清，加入荧光标记后的抗Foxp3抗体避光孵育；(6)洗涤细胞后加入PBS重悬细胞，流式细胞仪上机检测，获得荧光标记后的所述的γδT细胞亚群的数据；(7)结果分析：对所述的γδT细胞亚群的表达比例进行统计学分析，当检测到PD1+Foxp3+γδT细胞表达比例高时，表明AML患者的预后不良可能性大。步骤(1)中所述的淋巴细胞悬液的终浓度优选为1x106/100μL。步骤(2)中所述的抗CD45抗体的加入比例优选为每100μL的淋巴细胞悬液配比3～6μL所述的抗CD45抗体；进一步优选为每100μL的淋巴细胞悬液配比5μL所述的抗CD45抗体。步骤(2)中所述的抗CD3抗体的加入比例优选为每100μL的淋巴细胞悬液配比3～6μL所述的抗CD3抗体；进一步优选为每100μL的淋巴细胞悬液配比5μL所述的抗CD3抗体。步骤(2)中所述的抗TCRγδ抗体的加入比例优选为每100μL的淋巴细胞悬液配比3～6μL所述的抗TCRγδ抗体；进一步优选为每100μL的淋巴细胞悬液配比5μL所述的抗TCRγδ抗体。步骤(2)中所述的抗PD-1抗体或所述的抗PD-1抗体的同型对照抗体的加入比例优选为分别为每100μL的淋巴细胞悬液配比3～6μL所述的抗PD-1抗体或所述的抗PD-1抗体的同型对照抗体；进一步优选为本文档来自技高网...

【技术保护点】
新型γδT细胞亚群在制备用于预测AML疗效及预后评估试剂盒中的应用。

【技术特征摘要】
1.新型γδT细胞亚群在制备用于预测AML疗效及预后评估试剂盒中的应用。2.根据权利要求1所述的新型γδT细胞亚群在制备用于预测AML疗效及预后评估试剂盒中的应用，其特征在于：所述的γδT细胞亚群包括Foxp3+γδT细胞、PD-1+γδT细胞和PD1+Foxp3+γδT细胞中的一种或至少两种。3.一种预测AML患者临床疗效及预后评估的试剂盒，其特征在于，包括如下不同的荧光标记的单克隆抗体：抗CD45抗体、抗CD3抗体、抗TCRγδ抗体、抗PD-1抗体、所述的抗PD-1抗体的同型对照抗体和抗Foxp3抗体。4.根据权利要求3所述的预测AML患者临床疗效及预后评估的试剂盒，其特征在于：所述的抗CD45抗体的荧光标记为V450；所述的抗CD3抗体的荧光标记为AlexaFluor700；所述的抗TCRγδ抗体的荧光标记为PE/Cy7；所述的抗PD-1抗体或所述的抗PD-1抗体的同型对照抗体的荧光标记为PE；所述的抗Foxp3抗体的荧光标记为AlexaFluor647。5.根据权利要求3所述的预测AML患者临床疗效及预后评估的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒还包括所述的单克隆抗体各自对应的同型对照抗体。6.根据权利要求3所述的预测AML患者临床疗效及预后评估的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒还包括用于细胞染色破膜的试剂、用于分离外周血单个核细胞的试剂和磷酸盐缓冲溶液中的一种或至少两种。7.一种用于预测AML疗效及预后评估的γδT细胞亚群的检测方法，包括如下步骤：(1)处理待测外周血样本，形成单细胞悬液；(2)在步骤(1)得到的单细胞悬液中加入标记不同荧光的单克隆抗体：抗CD45抗体、抗CD3抗体、抗TCRγδ抗体、抗PD-1抗体、所述的抗PD-1抗体的同型对照抗体，轻轻混匀后避光孵育；(3)洗涤细胞后加入固定/破膜缓冲液，避光孵育，再次洗涤细胞，充分混匀后，离心去上清；(4)洗涤细胞，加入破膜缓冲液重悬细胞避光孵育；(5)离心去上清，加入荧光标记后的抗Foxp3抗体避光孵育；(6)洗涤细胞后加入PBS重悬细胞，流式细胞仪上机检测，获...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴秀丽，金真伊，李扬秋，丘丹，陈少华，杨力建，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：广东,44