一种猪伪狂犬病病毒gE蛋白抗体竞争ELISA检测试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种检测猪伪狂犬病病毒gE蛋白抗体的竞争ELISA检测试剂盒，包括辣根过氧化物酶标记的猪伪狂犬病病毒gE蛋白单克隆抗体，所述单克隆抗体由杂交瘤细胞株4E12分泌产生，所述杂交瘤细胞株4E12的保藏号为CCTCC NO：C2017205，试剂盒还包括：阴性对照、阳性对照、抗原包被板、底物液A、底物液B、终止液、样品稀释液、洗涤液，该试剂盒具有特异性强、敏感性高的特点。本发明专利技术还提供了所述试剂盒的检测方法，该方法特异性强、敏感性高、重复性好、与进口试剂盒检测符合率达96.11%，且1h之内获得结果，大幅度缩短检测时间，具有良好的应用前景。

A competitive ELISA detection kit and detection method for gE protein antibody of porcine pseudorabies virus

The invention discloses a box of competitive ELISA detection reagent for detection of pseudorabies virus gE protein antibody, pseudorabies virus gE protein monoclonal antibodies including horseradish peroxidase, the monoclonal antibody produced by the hybridoma cell lines secreting 4E12, accession number by the hybridoma cell line 4E12 CCTCC NO:C2017205. The kit also includes: negative control, positive control, antigen coated plate, substrate A, substrate liquid liquid B, termination liquid, sample diluent, washing liquid, the kit has the characteristics of high specificity and sensitivity. The invention also provides a detection method for the kit. The method has the advantages of high specificity, high sensitivity, good reproducibility, and the coincidence rate with the imported kit is up to 96.11%, and the result is obtained within 1h, which greatly shortens the detection time and has good application prospect.

【技术实现步骤摘要】
一种猪伪狂犬病病毒gE蛋白抗体竞争ELISA检测试剂盒及检测方法
本专利技术属于动物疫病检测领域，更具体地，涉及一种猪伪狂犬病病毒gE蛋白抗体竞争ELISA检测试剂盒及检测方法，适用于猪血清中gE蛋白抗体的检测。
技术介绍
伪狂犬病病毒(Pseudorabies,PRV)是疱疹病毒科(Herpesviridae)α疱疹病毒亚科的成员，可以引起猪、牛、羊及野生动物的伪狂犬病，猪是其主要宿主，伪狂犬病给养猪业造成了巨大的经济损失。鉴于伪狂犬病的巨大危害，欧美许多国家相继通过使用基因缺失疫苗和鉴别诊断方法，实现了该病的净化。目前商业化的伪狂犬疫苗均为gE基因缺失疫苗，疫苗免疫动物后不会产生gE抗体，因此可通过gEELISA抗体检测试剂盒检测猪血清中的gE蛋白抗体来监测猪只伪狂犬病毒感染情况，准确、及时地淘汰带毒病猪，逐步实现该病的净化和根除。目前，一般采用的间接ELISA，乳胶凝集等方法检测gE蛋白抗体，这些方法由于自身的特点必需依赖免疫原性好、高纯度的包被抗原才能得到准确的结果，但高纯度的包被抗原很难获得，运用这些方法必然存在灵敏度不高，特异性不好的问题。因此建立灵敏度高、特异性强、简便快速的gE蛋白抗体ELISA检测方法对猪伪狂犬病的净化和根除具有重要意义。
技术实现思路
针对上述现有技术中的问题，本专利技术提供了一种猪伪狂犬病病毒gE蛋白抗体竞争ELISA检测试剂盒，该试剂盒具有特异性好，灵敏度高，快速准确的特点。本专利技术的另一目的在于提供了所述试剂盒的检测方法。本专利技术的上述目的是通过以下技术方案予以实现的。一种猪伪狂犬病病毒gE蛋白抗体竞争ELISA检测试剂盒，包括辣根过氧化物酶标记的酶标抗体，所述酶标抗体为抗伪狂犬病病毒gE蛋白单克隆抗体，所述单克隆抗体由杂交瘤细胞株4E12分泌产生，所述杂交瘤细胞株4E12的保藏号为CCTCCNO：C2017205；保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2017年10月17日。优选的，所述单克隆抗体是由纯化的伪狂犬病病毒鄂A株为免疫原获得；所述伪狂犬病病毒鄂A株为灭活的。优选的，所述试剂盒中还包括抗原包被板、阴性对照、阳性对照、底物液A、底物液B、终止液、样品稀释液、洗涤液；所述抗原包被板的包被抗原为纯化的灭活伪狂犬病毒。所述抗原包被板为用0.1mol/L的pH9.6碳酸钠缓冲液将纯化的伪狂犬病毒稀释到一定浓度包被酶标板。所述阴性对照为未感染伪狂犬病毒的健康猪阴性血清；所述阳性血清为感染伪狂犬病毒的猪血清。所述样品稀释液为质量分数为0.1％酚红的PBS缓冲液。所述洗涤液为体积分数为0.05％Tween-20的PBS缓冲液。所述底物液A为含有50mg/mL过氧化氢脲的柠檬酸盐缓冲液；底物液B为含有0.2mg/mLTMBpH5.0的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液。所述终止液为体积分数为0.25％的氢氟酸溶液。所述抗伪狂犬病病毒gE蛋白的单克隆抗体，利用杂交瘤细胞技术(张权庚、张玉祥、丁卫等译，抗体制备与使用实验指南[M].北京：科学出版社，2010)，用纯化的伪狂犬病病毒免疫BALB/c小鼠，取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)进行细胞融合，用HAT选择性培养基进行培养后，再用包被有猪伪狂犬病毒鄂A株的酶标板和伪狂犬病毒gE/gI基因缺失株(参见中国专利技术专利申请公开说明书，专利申请号200510019513.8)的酶标板运用间接ELISA的方法进行筛选，阳性细胞株进行有限稀释的方法克隆，再用伪狂犬病毒感染猪的阳性血清和未被感染的健康猪阴性血清进行阻断ELISA筛选，最终筛选出有阻断效果的单克隆抗体，命名分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株4E12，保藏号：CCTCCNO：C2017205。优选的，所述抗原包被板的抗原包被浓度为1:5000，酶标抗体的稀释倍数为1:6000。本专利技术还提供所述的一种猪伪狂犬病病毒gE蛋白抗体竞争ELISA检测试剂盒的检测方法，包括如下检测步骤：1)从试剂盒中取出已包被纯化病毒的抗原包被板，分别将待检血清、阴性对照、阳性对照一定倍数稀释后各取50μl与所述酶标抗体50μl同时加入抗原包被板，其中每份样品设一孔，阴性对照、阳性对照各设两孔、振荡混匀，37℃孵育；2)洗板5次，最后一次在吸水材料上拍干；3)每孔先加底物液A50μl、再加底物液B50μl，混匀，室温避光显色，每孔加入终止液50μl终止显色，酶标仪读取OD630值；4)结果判定：试验成立的条件是阴性对照孔平均OD630nm值与阳性对照平均OD630nm值之差≥0.3；S＝样品孔OD630nm值，N＝阴性对照孔平均OD630nm值，若S/N比值＜0.6，样品判为gE抗体阳性，若S/N比值＞0.7，样品判为gE抗体阴性。优选的，步骤1)所述稀释的倍数均为5倍。优选的，步骤1)所述孵育的时间为30min。优选的，步骤3)所述避光显色的时间为15分钟，终止显色10分钟内读取酶标仪数值。优选的，步骤4)中若0.6≤S/N≤0.7，样品判为可疑；所述样品重测，如结果相同，则判为gE蛋白抗体阳性。与现有技术相比，本专利技术有益效果在于：(1)本专利技术包被抗原为纯化的灭活伪狂犬病毒，天然抗原免疫原性好。(2)本专利技术利用伪狂犬病毒gE蛋白特异性单克隆抗体，与传统试剂盒相比敏感性好，特异性高。(3)利用竞争ELISA的方法，待检血清样品与酶标单抗同时加入酶标板，操作更加方便，检测更加快速，检测时间仅45min。(4)试剂盒检测结果判定依据S/N值，科学合理，结果准确性好、可信度高。(5)本专利技术试剂盒的特异性强、敏感性高，更加稳定；检测方法的批间及批内重复性好、敏感性高、符合率试验优良，与进口试剂盒检测符合率达96.11％，大幅度缩短检测时间，具有良好的应用前景。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。除非特别说明，本专利技术采用的试剂、方法和设备为本
常规试剂、方法和设备。以下以具体实施条件为例对本专利技术方法进行进一步说明。实施例1包被抗原和制备抗伪狂犬病病毒gE蛋白的单克隆抗体的免疫原，通过以下步骤制备:(1)将冷冻干燥的PRV毒种加2mlDMEM培养基溶解，即为PRV鄂A株病毒液。将BHK-21细胞用含10％小牛血清的DMEM于37℃培养，细胞长成单层后，倒掉上清，添加含3％小牛血清的DMEM培养基至原体积，同时按原体积1％接种PRV鄂A株病毒液，置37℃继续培养24～72小时，80％左右细胞病变(CPE)时，收获PRV鄂A株病毒液加甲醛(终浓度为0.2％)置37℃灭活处理24小时。(2)将细胞瓶置于-20℃冰箱，反复冻融三次，收集病毒液。将病毒液在8000rpm，4℃，离心30min，弃沉淀。将上清再进行27000rpm离心2h，弃上清，沉淀用PBS(0.01mol/L，pH值7.4)重悬。(3)将重悬液进行蔗糖密度梯度离心，同时制备质量体积比为20％、35％、45％和60％的不连续梯度蔗糖溶液，将重悬病毒液加在20％蔗糖界面上，27000rpm离心90min，收集45％和60％蔗糖层间病毒液。(4)用PBS对收集的病毒液进行5倍稀释，在2～8℃条件下，以27000本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种猪伪狂犬病病毒gE蛋白抗体竞争ELISA检测试剂盒，其特征在于，包括辣根过氧化物酶标记的酶标抗体，所述酶标抗体为抗伪狂犬病病毒gE蛋白单克隆抗体，所述单克隆抗体由杂交瘤细胞株4E12分泌产生，所述杂交瘤细胞株4E12的保藏号为CCTCC NO：C2017205。

【技术特征摘要】
1.一种猪伪狂犬病病毒gE蛋白抗体竞争ELISA检测试剂盒，其特征在于，包括辣根过氧化物酶标记的酶标抗体，所述酶标抗体为抗伪狂犬病病毒gE蛋白单克隆抗体，所述单克隆抗体由杂交瘤细胞株4E12分泌产生，所述杂交瘤细胞株4E12的保藏号为CCTCCNO：C2017205。2.根据权利要求1所述的一种猪伪狂犬病病毒gE蛋白抗体竞争ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述单克隆抗体是由纯化的伪狂犬病病毒鄂A株为免疫原获得。3.根据权利要求1所述的一种猪伪狂犬病病毒gE蛋白抗体竞争ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括抗原包被板、阴性对照、阳性对照、底物液A、底物液B、终止液、样品稀释液、洗涤液；所述抗原包被板的包被抗原为纯化的灭活伪狂犬病毒。4.根据权利要求3所述的一种猪伪狂犬病病毒gE蛋白抗体竞争ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述抗原包被板的抗原包被浓度为1:5000，酶标抗体的稀释倍数为1:6000。5.权利要求1~4任一项所述的一种猪伪狂犬病病毒gE蛋白抗体竞争ELISA检测试剂盒的检测方法，其特征在于，包括如下检测步骤：1）从试剂盒中取出已包被纯化病毒的抗原包被板，分别将待检血...

【专利技术属性】
技术研发人员：韦奇勇，但汉并，范俊青，贾慧勤，周云朵，李盼盼，邹维华，张弛，马磊，董俊，董晓辉，徐高原，
申请(专利权)人：武汉科前生物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42