一种FcRn受体的ELISA检测方法技术

本发明专利技术要求保护一种FcRn受体的ELISA检测方法，其包括在酶标板上包被FcRn的包被步骤、封闭、样品配制、二抗孵育、底物显色的步骤，其中，所述样品配制步骤为：抗VEGF单抗与抗原混匀后，静置一个小时形成免疫复合物,另还加入肝素。另在包被步骤中，还加入连霉亲和素包被缓冲液到酶标板。利用本发明专利技术检测方法能在体外快速、直接检测出抗VEGF单抗与FcRn受体结合活性，且成本较低，实验操作方便，重复性好，结果判断客观、灵敏度高。为抗VEGF单抗的一致性评价及临床药效及药代动力学研究也提供了参考信息。

A method of ELISA detection for FcRn receptor

ELISA detection method of the invention claimed a FcRn receptor, including the ELISA plate coated FcRn package is closed, and steps of sample preparation, two anti incubation, chromogenic substrate steps, the sample preparation method comprises the following steps: Anti VEGF monoclonal antibody and antigen after mixing, static an hour in the formation of immune complexes, the other also added heparin. In addition, in the process of inclusion, streptavidin package was added to the enzyme labeled plate. The detection method of the invention can detect the binding activity of anti VEGF McAb with FcRn receptor in vitro quickly and directly, and has low cost, convenient operation and good repeatability, and the result is objective and sensitive. It also provides reference information for the consistency evaluation of anti VEGF monoclonal antibody and the study of clinical efficacy and pharmacokinetics.

【技术实现步骤摘要】
一种FcRn受体的ELISA检测方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种FcRn受体的ELISA检测方法。
技术介绍
血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)，是血管内皮细胞特异性的肝素结合生长因子，可在体内诱导血管新生。VEGF由不同肿瘤细胞分泌，也可在发育中的正常细胞及组织中表达，在体内调节血管的通透性，为血管形成过程中的多种细胞提供一个纤维网络；在体外能促进基质的降解以及内皮细胞的增殖、迁移、运动和血管腔样结构的形成，并可动员骨髓来源的内皮祖细胞。VEGF是诱导肿瘤血管形成的作用最强、特异性最高的血管生长因子。所以理论上来说，采用不同方法来干预或抑制血管内皮生长因子可以抑制肿瘤的生长。抗VEGF单抗是采用重组DNA技术通过中国仓鼠卵巢(Chinesehamsterovary，CHO)细胞表达系统生产的重组人源化单克隆IgG1抗体，包含93％的人源单抗序列和7％的可结合人VEGF的鼠源单抗互补决定区序列，重链由453个氨基酸组成，轻链由214个氨基酸组成，分子量大约为149kDa。治疗性单克隆抗体被广泛用于肿瘤、自身免疫性疾病、感染性疾病等治疗。单抗除具有特异性高、不良反应小和作用机制明确等特点外，半衰期长也是其独特的优势。当前的治疗性单抗大多为免疫球蛋白G(immunoglobulinG，IgG)，其在体内半衰期主要受Fc段与新生儿Fc受体(neonatalFcreceptor，FcRn)亲和力的影响，亲和力降低或提高可导致单抗体内半衰期的缩短或延长，通过IgG-FcRn亲和力可以预测IgG的体内半衰期。因此，测定单抗与FcRn的亲和力可以作为评价单抗药代动力学的间接指标。近年来，单抗生物类似药以及Fc段改造和修饰类单抗不断涌现，评价该类单抗药物与FcRn亲和力的改变成为指导产品研发和生物类似药可比性研究的重要指标。IgG与FcRn的结合呈现pH依赖的特点，在溶酶体内的低pH值条件下(pH5.5-6.5)，IgG与FcRn结合使IgG免于降解，待IgG-FcRn复合物返回细胞表面后，在中性体液条件下，结合力降低，IgG释放回体液中。近年来，生物膜干涉技术(biolayerinterferomeory，BLI)、biacore技术等被用于FcRn受体结合活性的测定，虽然简便快捷，但需要价格昂贵的大型设备，不利于普通实验室、小型生物公司的技术研发及产品质量的跟踪监测。而酶联免疫吸附测定法(ELISA)方法，因其操作简单、快速、敏感性高、特异性强、设备要求简单，因此在实验室广泛应用。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是本专利技术创新性的利用夹心ELISA方法检测抗VEGF单抗与FcRn受体的结合能力，使抗体样品体外与FcRn受体的结合活性的检测更加简单易行。为了解决上述技术问题，本专利技术提供的技术方案为一种用ELISA方法检测抗VEGF单抗与FcRn受体的结合活性，即一种FcRn受体的ELISA检测方法,其包括在酶标板上包被FcRn受体的包被步骤、封闭、样品配制、二抗孵育、底物显色的步骤，且所述样品配制步骤为：抗VEGF单抗与抗原混匀后，静置一个小时形成免疫复合物。本专利技术优选的技术方案中，抗VEGF单抗与抗原的摩尔比在0.1～10:1之间；优选地，所述抗VEGF单抗与抗原的摩尔比在0.5～5:1之间，更优选地，抗VEGF单抗与抗原的摩尔比在1～3:1之间。本专利技术优选的技术方案中，所述样品配制步骤中,还加入肝素，且加入的肝素在反应体系的终浓度≥0.05U/mL，优选为加入的肝素终浓度为0.05U/mL～5.00U/mL；更优选地，加入的肝素终浓度为0.05U/mL～0.50U/mL。以此，在反应过程中，形成抗原-抗体-肝素的超级复合物，增加了受体亲和度。本专利技术优选的技术方案中，在包被步骤中，还加入连霉亲和素包被缓冲液到酶标板，优选地，连霉亲和素浓度为0.1～10μg/ml。本专利技术中，通过加入连霉亲和素，能够增加受体包被处理量，即增加包被受体浓度。本专利技术优选的技术方案中，将所述的免疫复合物进行梯度稀释，加入包被好FcRn的酶标板上进行孵育。本专利技术优选的技术方案中，所述抗VEGF单抗为贝伐珠单抗(Avastin)。本专利技术优选的技术方案中，所述抗VEGF单抗的分子式及分子量为：C6638H10160N1720O2108S44149kDa，其轻链氨基酸序列如下：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC；重链的氨基酸序列为：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK。本专利技术的抗VEGF抗体FcRn受体结合活性检测方法是基于ELISA方法，利用平行曲线(四参数曲线)模型测定相对活性。利用本专利技术检测方法能在体外快速、直接检测出抗VEGF单抗与FcRn受体结合活性，且成本较低，实验操作方便，重复性好，结果判断客观、灵敏度高。为抗VEGF单抗的一致性评价及临床药效及药代动力学研究也提供了参考信息。附图说明图1为FcRn受体与抗VEGF单抗结合活性检测方法检测原理图。图2为实施例1的FcRn与抗VEGF单抗结合曲线图。从图中可知，采用加入肝素的方法，参数曲线可以很好达到上平台，而现有技术的检测方法是无法达到的。图3为实施例2的FcRn与抗VEGF单抗结合曲线图。从图中可知，采用连霉亲和素包被缓冲液的方法，参数曲线可以很好达到上平台，而已知的检测方法是无法达到此技术效果的。图4A为抗VEGF单抗的轻链氨基酸序列图；图4B为抗VEGF单抗的重链氨基酸序列图。具体实施方式以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本专利技术而不限于限制本专利技术的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做进一步调整，未注明的实本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种FcRn受体的ELISA检测方法，其特征在于，其包括在酶标板上包被FcRn的包被步骤、封闭、样品配制、二抗孵育、底物显色的步骤，其中，所述样品配制步骤为：抗VEGF单抗与抗原混匀后，静置一个小时形成免疫复合物。

【技术特征摘要】
1.一种FcRn受体的ELISA检测方法，其特征在于，其包括在酶标板上包被FcRn的包被步骤、封闭、样品配制、二抗孵育、底物显色的步骤，其中，所述样品配制步骤为：抗VEGF单抗与抗原混匀后，静置一个小时形成免疫复合物。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述样品配制步骤中,还加入肝素，且加入肝素的终浓度为0.05U/mL～5.00U/mL。3.根据权利要求1或2...

【专利技术属性】
技术研发人员：龙水清，艾洪新，刘西燕，朱文娟，
申请(专利权)人：东曜药业有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32